戊己丸是临床上治疗肠易激综合症、胃溃疡等消化道疾病的常用方剂，是收录于2010年版药典中的经典名方，其在《幼幼新书》、《太平惠民合剂局方》、《医方考》等历代医书中均有记载。戊己丸由黄连，吴茱萸和土炒白芍3味药组成，然历代医书中记载的戊己丸配伍比例却不尽相同，2010年版药典收录戊己丸由黄连-吴茱萸-土炒白芍6∶1∶6组成[1]。
[摘要]采用L9（34）正交设计将戊己丸中黄连，吴茱萸，白芍提取物组成9组配伍方，以及相应剂量的单味药方，共计18个方。建立并采用UPLC-MS/MS方法测定并比较不同配伍方代表成分小檗碱、巴马汀、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、芍药苷在大鼠口服给药2h后在肝脏中的浓度比较戊己丸不同配伍方中有效成分在大鼠肝脏中的浓度。结果显示戊己丸配伍方中有效成分在肝中的浓度与相同剂量的单味药组方存在明显差异，相同剂量配伍方之间也存在差异。黄连与低、高剂量吴茱萸中吴茱萸碱浓度成正相关，吴茱萸与低剂量黄连中小檗碱的浓度成负相关，与中剂量黄连中小檗碱的浓度成正相关，与中剂量白芍中芍药苷浓度成正相关。白芍与中剂量黄连中巴马汀浓度成负相关、与中剂量吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱浓度成负相关。提示了黄连、吴茱萸、白芍之间相互作用导致了各活性成分在肝中分布的差异，分析显示各代表成分2h在肝中浓度最大的配伍比为12∶6∶6。
[关键词]药剂师职称论文,戊己丸,配伍,肝脏分布
有研究表明，戊己丸配伍不同，其药效也不尽相同。王娅杰等[2]通过比较戊己丸提取物黄连-吴茱萸-白芍12∶2∶3与12∶1∶12的优选方对豚鼠离体结肠运动的影响，发现二者均可抑制乙酰胆碱诱导的结肠运动亢进，却呈现出不同的作用特点和优势。宫海民等[3]比较了2种不同配伍比例的戊己丸的药效，发现黄连-吴茱萸-白芍1∶1∶1时长于镇痛，5∶1∶1时长于抗炎。为此，本课题组采用药代动力学的技术和手段，通过研究和比较戊己丸不同配伍组方有效成份在体内的吸收和处置情况，探究各单味药之间的相互作用和配伍规律，进而阐释戊己丸的配伍原理及机制。
肝是机体的最重要的代谢器官。课题组前期通过血药浓度-时间曲线[4]以及体外肝微粒CYP450酶代谢模型[5-6]、肝灌流模型[7]研究发现，戊己丸配伍不同，体内的药代动力学参数、对肝中CYP450酶的影响以及肝脏对各代表成份的摄取均存在明显的差异。然而，药物通常要分布到肝实质细胞里才能跟细胞内的代谢酶发生相互作用（生物转化或影响代谢酶活性）抑或通过胆汁排泄[8]。因此，了解药物在肝脏中的分布有着重要意义。
本实验在之前研究的基础上，采用正交设计，将戊己丸三味药的提取物组成不同配伍方，以期通过研究各配伍方的在肝中的分布特征，更为深入的了解药物在肝脏乃至体内的处置过程，同时冀求从分布的角度探索戊己丸配伍的规律及意义，为更深入的研究戊己丸的配伍机制提供基础。
1材料
1.1动物
雄性Sprague-Dawley大鼠，SPF级，体重（220±20）g，中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所提供，合格证号SCXK（京）2009-0017。在恒温，光照周期12h∶12h环境中饲养3d后实验。
1.2仪器
超高效液相色谱-质谱联用仪（WatersXevoTQMS-AcquityUPLCSystem，MasslynxV4.1工作站）；MSU225S-000-DU型1/10万电子分析天平（德国Sartorius公司）；PotterS型匀浆机（德国Sartorius公司）；VX-Ⅲ型多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）；NA-5L型氮空一体机（北京中兴汇利科技发展有限公司）；Centrifuge5424R型低温高速离心机（德国eppendorf公司）；Milli-QAdvantageA10超纯水系统（美国Millipore公司）。
1.3试剂与试药
盐酸小檗碱（Ber，批号110713-201212），盐酸巴马汀（Pal，批号110732-201108），吴茱萸碱（Evo，批号110802-200606），吴茱萸次碱（Rut，批号110801-201006），芍药苷（Pae，批号110736-201136），盐酸苯海拉明（Dip，批号100066-200807），栀子苷（Gar，批号110749-200714），对照品均购自中国食品药品检定研究院。乙腈，甲醇，甲酸均为色谱纯（美国Fisher公司）。高纯水（自制）。
黄连提取物、吴茱萸提取物、白芍提取物由中日友好医院药剂室提取，得率分别为19.3%，17.7%，9.37%，均为真空干燥固体粉末。其中各提取物中代表成分的质量分数分别为：黄连提取物中Ber23.03%，Pal5.52%；吴茱萸提取物中Evo0.38%，Rut0.48%；白芍提取物中Pae13.41%。本实验配伍方为各单味药提取物的混合，且全部实验均采用同一批次的提取物。
2方法
2.1戊己丸配伍方设计
采用L9（34）正交设计，将戊己丸中黄连、吴茱萸、白芍3味药作为不同因素，根据2010年版药典临床剂量及配比和历代医方记载之配比，设计各单味药的高中低剂量，作为3个水平，得到9个配伍方（1#～9#），同时设3味药相应剂量的单味药对照（10#～18#）。共计18个组方，见表1。
2.2标准溶液的配制
精密称取适量的Ber，Pal，Evo，Rut，Pae，Dip，Gar对照品，用甲醇溶解，分别配制成100，100，25，25，20mg・L-1，1，2g・L-1的储备液，于4℃冰箱中保存，备用。2.3给药与脏器采集
90只大鼠随机分成18组，禁食12h后，以20μL・g-1的灌胃体积灌胃1～18号方戊己丸提取物溶液。灌胃后2h放血脱脊椎处死大鼠，迅速取出肝组织，生理盐水洗净表面血迹，用滤纸吸干表面水分。称重记录，于-80℃冰箱中保存备用。
2.4组织样品预处理方法
将于-80℃冰箱中保存的给药组肝组织及空白组肝组织取出，室温下解冻。按3mL・g-1的量加入含10%氨水的生理盐水在冰浴中匀浆。取270μL给药组肝匀浆液，加30μL甲醇溶液，加30μL内标（Dip2mg・L-1，Gar20mg・L-1），加1470μL乙腈沉淀蛋白，以4℃，12000r・min-1离心15min，取上清液1500μL，25℃氮气吹干。残渣用1800μL含有1%甲醇的乙酸乙酯溶解，4℃，12000r・min-1离心15min，取上清液1440μL，25℃氮气吹干。残渣用250μL50%乙腈再次溶解，3μL进样分析。
2.5样品分析条件
2.5.1液相条件WatersAcquityUPLCSystem，ACQUITYUPLCBEHShieldRP18色谱柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；流动相A为乙腈，B为0.2%甲酸；采用梯度洗脱，单个样品分析时间为7min；0～3.5min，2%～40%A；3.5～4.5min，40%～80%A；4.5～5.0min，80%～90%A；5.0～5.5min，80%～90%A；5.5～6.0min，90%～40%A；6.0～6.1min，40%～2%A；6.1～7.0min，2%A；流速0.4mL・min-1，柱温35℃。
2.5.2质谱条件采用电喷雾电离离子源（ESI），正负离子模式同时检测，选择MRM模式进行二级质谱分析。其中Ber（m/z335/320），Pal（m/z352/336），Evo（m/z304/134），Rut（m/z288/115），Dip（m/z256/152）在正离子模式下检测，毛细管电压1.00kV，锥孔电压50V，离子源温度150℃，脱溶剂温度500℃，脱溶剂气体流速800L・Hr-1，锥孔气体流速50L・Hr-1，碰撞能20eV；负离子模式下检测Pae（m/z525/449），Gar（m/z387/225），毛细管电压2.50kV，锥孔电压32V，离子源温度150℃，脱溶剂温度500℃，脱溶剂气体流速800L・Hr-1，锥孔气体流速50L・Hr-1，碰撞能8eV。
2.6方法学评价
2.6.1方法专属性将空白肝匀浆、加有检测成份的空白肝匀浆及灌胃后的肝匀浆按2.4项下样品处理方法进样对比分析。
2.6.2标准曲线与线性范围取对照品储备液，用甲醇稀释成不同浓度的混标溶液。其中Ber和Pal为20，50，100，200，400，600，800，1200，1600，2000μg・L-1；Evo和Rut为5，12.5，25，50，100，150，200，300，400，500μg・L-1；Pae为4，10，20，40，80，120，160，240，320，400μg・L-1。
取空白肝组织匀浆液270μL，加入30μL上述不同浓度的混标溶液，加30μL内标溶液。按2.4项下样品处理方法制备进样，以各样品质量浓度（X）为横坐标，以检测样品峰面积与内标峰面积的比值（Y）为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归（权重1/X2），得回归方程。
2.6.3日内、日间精密度及准确度以空白肝组织样品，根据线性范围不同，选取高浓度混标（Ber和Pal1600μg・L-1，Evo和Rut400μg・L-1，Pae320μg・L-1），中浓度混标（Ber和Pal400μg・L-1，Evo和Rut100μg・L-1，Pae80μg・L-1），低浓度混标（Ber和Pal50μg・L-1，Evo和Rut12.5μg・L-1，Pae10μg・L-1），按2.4样品处理方法，制备成高、中、低3个浓度的质控样品。并将3个浓度样品分别制备5份，连续检测3d。根据随行标准曲线计算日内、日间精密度和准确度。
2.6.4回收率空白肝组织匀浆液，取30μL50%乙腈代替2.4项样品处理方法中的内标，制备高中低3个浓度的样品，每个浓度平行制备8份，记录峰面积。并与相应浓度实际进样量的标准溶液峰面积相比，计算绝对回收率。
2.6.5稳定性考察各代表成分及内标的稳定性包括：储备液的长期稳定性（储备液在-80℃条件下保存4个月）；大鼠肝匀浆样品中长期稳定性（肝匀浆在-80℃保存1个月）；大鼠肝匀浆样品在前处理过程中的稳定性及冻融稳定性（肝匀浆室温下放置3h后提取及反复冻融一次后提取）；在复溶溶剂中的短期稳定性（4℃自动进样器中放置24h）。
2.7数据处理
质谱数据采用Waters公司Masslynx4.1工作站进行峰提取，峰积分等处理；采用内标法，用线性回归方程计算各成分在肝脏中的浓度，权重因子1/X2，其中Ber，Pal，Evo，Rut选取Dip作为内标，Pae选取Gar作为内标；采用SPSS19.0对数据进行分析，结果以柱状图（±s）来表示。组间比较采用t检验，显著性检验水平设为α=0.05。选择5种化合物浓度的平均值作为指标进行正交设计方差和极差分析，确定对于各代表成分的最优配伍组合及对全方的贡献度、贡献形式。3结果与分析
3.1方法学结果
3.1.1方法专属性结果表明Ber，Pal，Evo，Rut，Pae以及内标Dip，Gar峰型良好，脏器中的内源性物质对检测没有干扰，检测成份相应值较高，方法专属性良好，见图1。
3.1.2标准曲线与线性范围按2.6.2下配制标准品并得到标准曲线，各成分线性范围及回归方程，见表2。
3.1.3日内、日间精密度及准确度结果显示，高中低3个浓度的Ber，Pal，Evo，Rut，Pae日内准确性为93%～105%，其精密度2.6%～13.2%；日间准确性为96%～106%，其精密度为2.6%～12.1%。准确度均在（100±10）%，精密度均在15%以内，符合生物样品分析方法的要求，见表3。
3.1.4回收率结果显示各代表成分高中低3个浓度的回收率稳定，RSD均在15%以内，符合生物样品分析方法的要求，见表4。
3.1.5稳定性实验结果表明，储备液在-80℃下保存4个月各成份均稳定未变。肝匀浆样品在-80℃保存1个月所有被测成份峰面积基本未变。质控样品匀浆液在室温下放置3h后提取，各成份峰面积基本不变。质控样品复溶液在4℃自动进样器中放置24h，峰面积基本稳定。质控样品冻融1次后再提取，各代表成分峰面积均有显著降低，因此实验保证在解冻后均一次性处理。
3.2给药肝组织样品测定与分析
取2.4项下样品分析，测定各配伍方中Ber，Pal，Evo，Rut，Pae给药后2h在肝中的浓度。
3.2.1不同配伍方对Ber分布的影响统计各配伍方Ber浓度，结果显示①黄连低剂量组Ber浓度大小为1#>10#>2#>3#，而吴茱萸用药量为3#>2#>1#，提示与吴茱萸的用药量成负相关，低剂量的吴茱萸可以促进Ber在给药2h后在肝中的浓度。②黄连中剂量组Ber浓度为6#>5#>11#>4#，吴茱萸用药量为6#>5#>4#，提示与吴茱萸用药量成正相关，高剂量的吴茱萸促进Ber在给药2h后在肝中的浓度。③黄连高剂量组配伍方中Ber浓度均大于同剂量单味药方（P<0.05），提示配伍方可以显著提高Ber在给药2h后在肝脏中的浓度，其中9#>7#>8#，见图2。
3.2.2不同配伍方对Pal分布的影响统计各配伍方Pal浓度，结果显示①黄连低剂量组配伍方中Pal浓度均大于同剂量单味药方（P<0.01），提示配伍方可以显著提高Pal在给药2h后在肝中的浓度。②黄连中剂量组配伍方中Pal浓度均小于同剂量单味药方，提示配伍方抑制了Pal的在肝中的浓度；其中6#>4#>5#，而白芍用药量为5#>4#>3#，与白芍的用药量成负相关，提示白芍可以抑制Pal给药2h后在肝中的浓度。③高剂量组配伍方Pal浓度均显著大于同剂量单味药方（P<0.01），提示配伍方可以显著提高Pal在给药2h后在肝中的浓度，见图3。
3.2.3不同配伍方对Evo分布的影响统计各配伍方Evo浓度，结果显示①吴茱萸低剂量组Evo浓度为7#>4#>13#>1#，黄连与白芍的用药量为7#>4#>1#，提示与黄连和白芍的用药量成正相关，高剂量的黄连与白芍可以促进Evo在给药2h后在肝中的浓度；②吴茱萸中剂量组配伍方中Evo浓度均小于同剂量单味药方，其中8#>2#>5#，白芍的用量为5#>2#>8#，提示与白芍的用量成负相关，白芍抑制了Evo在给药2h后在肝中的浓度；③高剂量组配伍方Evo浓度均小于同剂量单味药方（P<0.01），提示配伍方抑制Evo在给药2h后在肝中的浓度；其中9#>6#>3#，黄连的用药为9#>6#>3#，提示与黄连的用药成正相关，见图4。
3.2.4不同配伍方对Rut分布的影响统计各配伍方中Rut浓度，结果显示①低剂量组配伍方中Rut浓度均大于同剂量单味药方（P<0.01），提示配伍方可显著促进Rut给药2h后在肝中的浓度；②中剂量组配伍方Rut浓度均小于同剂量单味药方，其中8#>2#>5#，同时白芍的用量为5#>2#>8#，提示与白芍的用量成负相关，白芍抑制Rut在给药2h后在肝中的浓度；③高剂量组配伍方中Rut浓度均大于同剂量单味药方（P<0.01），提示配伍方可以提高Rut在给药2h后在肝中的浓度，见图5。
3.2.5不同配伍方对Pae分布的影响统计各配伍方中Pae浓度，结果显示①白芍低、中剂量组单味药组方（16#，17#）中Pae浓度均低于定量下限，而配伍方中Pae浓度均高于定量下限，提示白芍低、中剂量时配伍方可以显著提高Pae在给药2h后在肝中的浓度；②其中白芍中剂量组为9#>2#>4#，吴茱萸用量为9#>2#>4#，提示与吴茱萸用量成正相关；③高剂量组5#Pae浓度低于定量下限，配伍方中7#高于18#（P<0.01），3#低于18#，见图6。
3.2.6各代表成分正交方差分析、极差分析结果以各代表成分在2h肝浓度的平均值为指标，通过正交设计方差分析及极差分析确定相对于各代表成分的最优组合，以及各因素间的主次关系、贡献形式以及贡献度大小，见表5。贡献度表示各因素对代表成分在肝中浓度的影响程度，贡献度越大说明其对代表成分分布浓度影响越大，贡献形式分为促进分布（+，正相关）与抑制分布（-，负相关），由此得到的影响因素的大小排序即为贡献度排序。从统计结果中可以看出，黄连对Ber，Pal，Pae在肝中浓度起主要作用，其次为吴茱萸和白芍；且黄连与Ber，Pal为正相关，即增大黄连的用量可以增大Ber，Pal在肝中的浓度，黄连用量与Pae没有表现出明显的相关性；对于Evo，三味药的主要贡献度为吴茱萸>黄连>白芍，其中吴茱萸对Evo为负相关，黄连对Evo为正相关，即增大黄连的用量，减少吴茱萸的用量可以增大Evo的浓度大小；对于Rut，三味药的主要贡献度为吴茱萸>白芍>黄连，且吴茱萸与Rut成正相关，及增大吴茱萸的用量，可以提高Rut在肝中的浓度。当黄连-吴茱萸-白芍12∶6∶6时可使Ber，Pal，Evo，Rut浓度最大；使Pae浓度最大的配伍比为黄连-吴茱萸-白芍12∶1∶6。因此，综合考虑5个代表成分，得出戊己丸在2h在肝脏中浓度最大的最优配伍比为黄连-吴茱萸-白芍12∶6∶6。4小结与讨论
组织中的药物通常因为含量较低而不易测出，为此，本实验采用了液质联用的技术手段，同时选择了较传统HPLC有着更高柱效与分离度的UPLC液相系统及1.7μm粒径的UPLC柱，大大缩短了分析时间。比较了各成份在ESI与APCI2种不同电离模式下响应情况，选择了ESI离子源。同时选择Dip，Gar双内标来分析中正负离子模式同时监测。
被测成份Ber，Pal，Evo，Rut均具有碱性，碱化样品有助于提高整个处理过程的回收率，因此本实验采用含10%氨水的生理盐水匀浆，碱化匀浆液。为了达到良好的检测效果，同时避免组织中杂质对样品和仪器造成的干扰和污染，样品预处理通过蛋白沉淀后2次复溶，在保证方法稳定可靠的同时，确保了将蛋白及极性较大的内源性杂质的干扰和污染降至最低，同时延长了色谱柱的使用寿命。
肝组织及其匀浆液中含有大量药物代谢酶，本实验采取多种措施以保证各检测成份在分析过程中的稳定性。包括脏器取出称重后立即放于-20℃冰箱中并转移至-80℃冰箱中保存直至匀浆；肝匀浆后立即进行提取处理，为防止反复冻融，减少1次匀浆的数量，确保一次性处理完毕；样品复溶后立即放置于-4℃自动进样器中；所用标准溶液均按每次实验的用量计算分装，并于-80℃冰箱中保存，解冻后均一次性使用。
根据前期药代动力学研究得到的血药浓度-时间曲线[4]，本实验选择2h作为考察时间点，此时各代表成分在组织和血液之间的分布基本已达到平衡。根据各代表成分浓度之间的比较分析，结果显示给药2h后①对于Ber：随着黄连用量的增大，Ber在肝中的浓度逐渐增大。大剂量配伍方可以显著提升Ber在肝中的浓度；黄连用量为低、中剂量时，Ber的分布均与吴茱萸有关，低剂量的吴茱萸对低剂量黄连组Ber的浓度有着促进作用，而对中剂量黄连组为抑制作用。②对于Pal：其浓度大小均与黄连的用量成正相关，当黄连用量为低、高剂量时，配伍可以显著提高Pal的浓度；黄连中剂量时，配伍略微抑制Pal的分布，主要抑制因素为白芍，随着白芍用量增大，抑制作用增强。③对于Evo：随着吴茱萸用量的增加，Evo在肝中的浓度增大，但配伍方对Evo浓度的抑制作用随之加大；当吴茱萸低剂量时，低剂量的黄连和白芍Evo的作用为抑制，而增大二者的用量，则促进Evo在肝中的浓度；吴茱萸中剂量时，白芍为主要作用因素，随白芍用量增大Evo浓度减小，吴茱萸高剂量时，黄连为主要作用因素，随着黄连用量减少，Evo浓度减小。④对于Rut，随着吴茱萸用量的增大，Rut浓度增大，当吴茱萸用量为低、高剂量时，配伍方对Rut浓度大小起促进作用，吴茱萸用量为中剂量时，配伍方对Rut起抑制作用，且白芍为主要因素，随白芍用量增加，对Rut的抑制作用增加。⑤对于Pae：白芍用量低、中剂量时，配伍方可以显著提高Pae的浓度，且中剂量时随着吴茱萸用量的增加，Pae浓度加大。
通过正交方差分析与极差分析，结果显示，增大黄连的用量可以增大Ber，Pal，Evo在肝中的浓度；增大吴茱萸的用量可以增大Rut在肝中的浓度，降低Evo在肝中的浓度；初步得到戊己丸在肝中浓度最大的配伍组合为黄连-吴茱萸-白芍12∶6∶6。
本实验仅从组织分布的角度初步探索了戊己丸的配伍规律，然而中医药理论博大精深，影响药物体内分布的因素环节又复杂多样。因此，如何借助药代动力学的技术和手段，从多层次多角度去探讨方剂的配伍机制，仍是笔者今后努力的方向。
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