地榆总皂苷（DYS）促造血作用已从体内外研究中获得证实[1]，作者前期的研究发现[2]，DYS可单独或协同细胞因子促进造血细胞增殖，尤其，DYS单独处理能显著增加依赖促血小板生成素（TPO）生长的Baf3/Mpl细胞增殖，且在mRNA水平促进TPO受体（TPOR）的表达。
[摘要]目的：观察地榆总皂苷（DYS）对Baf3细胞和32D细胞的促增殖和分化作用，以及对IL-3受体和干细胞因子受体c-kit表达水平的影响。方法：培养依赖IL-3生长的Baf3细胞和32D细胞，在加或不加IL-3条件下，用质量浓度为5，10，20，30，40mg・L-1的DYS分别处理细胞24，48，72，96h后，采用CCK8方法检测细胞增殖；并用Giemsa染色检测细胞分化；另以RT-PCR方法检测DYS对Baf3细胞IL-3受体及对32D细胞c-kit表达水平的影响。结果：DYS单独处理细胞48h，明显促进Baf3细胞和32D细胞增殖；与对照细胞比较，DYS处理32D细胞呈现成簇生长并形成许多大的细胞团；在加入IL-3的条件下，DYS也能明显增强IL-3的促细胞增殖作用。此外，DYS高浓度单独处理32D细胞可明显诱导多倍体巨核细胞数增加，促进巨核细胞分化。在mRNA水平，DYS单独处理细胞也能明显上调IL-3受体和c-kit的表达。结论：地榆总皂苷单独作用能促使2种巨核祖细胞的增殖和分化，其作用与上调IL-3受体和c-kit表达水平有关。
[关键词]药学期刊发表论文,地榆总皂苷,造血细胞增殖,巨核细胞分化,白细胞介素3,白细胞介素3受体,干细胞因子受体
Baf3/Mpl细胞源自于小鼠髓系巨核祖细胞系Baf3，后者依赖IL-3生长。通过转入TPOR后，Baf3细胞也可依赖TPO生长，因此命名为Baf3/Mpl细胞。尽管已证实DYS单独能促进Baf3/Mpl细胞增殖，且与上调TPO受体表达水平有关，但Baf3/Mpl细胞也表达IL-3受体，DYS的促增殖作用与IL-3受体是否也有关联，尚值得进一步探索。本研究采用未经Mpl受体转染的Baf3亲本细胞在加入或缺乏IL-3的体外培养条件下，观察地榆总皂苷对细胞生长的影响，同时研究了地榆总皂苷对IL-3受体表达的影响；另选择了依赖IL-3生长的32D小鼠髓系祖细胞系，研究了地榆总皂苷的促增殖作用，并观察了DYS诱导巨核细胞分化的作用以及对干细胞因子受体c-kit表达的影响，为进一步探索促造血的多效性奠定基础。
1材料
1.1地榆总皂苷制备取干燥地榆（购自成都市五块石药材市场，并由成都中医药大学贾敏如教授鉴定为地榆SanguisorbaofficinalisL.）粉碎成粗粉，称取500g并加入10倍量95%乙醇浸泡30min，回流提取3次，每次60min，尼龙布过滤；合并提取液，减压过滤得透明微红色液体，减压回收乙醇，加水混悬，保温至60℃，乙酸乙酯趁热萃取，连续3次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，即得地榆总皂苷粗提物。HPLC测定地榆皂苷I质量分数大于70%。使用前用DMSO溶解，无菌PBS稀释至1g・L-1，待用。
1.2试剂与仪器RPMI1640培养基（Gibco）；新生胎牛血清（HyClone）；重组小鼠白介素3（mIL-3，Sigma公司）；一步法RT-PCR试剂盒（Takara）；二氧化碳培养箱（Sanyo公司）；普通光学显微镜和倒置相差显微镜（Olympus公司）；多功能酶标仪（PerkinElmer公司）。
2方法
2.1细胞及细胞培养依赖IL-3生长的Baf3细胞和32D细胞系均购买自ATCC。细胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，IL-3（2μg・L-1）参照说明补充加入培养体系中。
2.2细胞增殖测定Baf3和32D细胞维持培养在对数生长期，用无血清培养基洗涤3次，悬浮于含0.5%胎牛血清的无细胞因子培养基中，次日以适量细胞数分别接种于96孔培养板内，分别设置空白对照组、地榆总皂苷单独处理组、IL-3单独处理组、地榆总皂苷+IL-3处理组。用无IL-3、无血清培养基稀释地榆总皂苷溶液，按照设置浓度加入细胞，使其终质量浓度分别为5，10，20，30，40mg・L-1，IL-3浓度参照细胞维持生长所需浓度加入。细胞在37℃条件下连续培养至指定时间，采用CCK8试剂盒并参照说明书提供的方法进行细胞增殖检测。
2.3Giemsa染色和巨核细胞计数Baf3和32D细胞分别接种于6孔板中，采用较高质量浓度（40mg・L-1）的DYS分别处理2种细胞，Baf3细胞在DYS处理120h后涂片用甲醇固定5min，Giemsa染色10min，染色后的标本用缓冲液洗涤，晾干，显微镜观察其形态学变化；32D细胞在DYS处理9d后光学显微镜下以细胞核内分裂分类计数100个细胞中的多倍体巨核细胞数，分类以双核为4N，4核为8N，依此类推。
2.4RT-PCR检测Baf3细胞和32D细胞分别接种在6孔培养板，加入地榆总皂苷溶液（10mg・L-1），37℃条件下继续培养，分别于24，48，72h收获细胞，用Trizol试剂提取总RNA。参照RT-PCR试剂盒扩增细胞内目的基因，各基因引物均由作者设计，上海基康生物技术有限公司合成，引物序列及产物片段大小见表1。IL-3R与c-kit扩增条件均为逆转录（RT）：50℃30min；94℃2min；PCR扩增条件：94℃15s，48℃15s，72℃45s，24～26个循环；最后延伸72℃10min，4℃1h。同时设置内参基因GAPDH的扩增，循环数为24，其余同目的基因扩增。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照，同时采用半定量方法（目的基因/GAPDH）计算目的基因表达水平。2.5统计学方法数据分析采用SPSS17.0统计软件包处理，实验数据均以±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析。
3结果
3.1DYS对Baf3细胞增殖的影响Baf3细胞在缺乏IL-3培养条件时，细胞增殖明显受抑制，但在含IL-3的培养条件下，Baf3细胞增殖明显，证实Baf3细胞依赖IL-3生长；在不含IL-3的培养条件下加入DYS（10mg・L-1）后，Baf3细胞数量也明显增加，并呈时间依赖；在含IL-3的培养条件下加入DYS（10mg・L-1），Baf3细胞数量增加更为明显，并优于IL-3单独刺激的细胞增殖结果。为了证实DYS的浓度依赖关系，进一步的研究结果显示：在不加IL-3的条件下，DYS促进细胞增殖的作用仅在20mg・L-1范围内，超过此浓度范围，细胞增殖减弱并呈现抑制细胞增殖的作用，但观察到细胞胞体变大的现象，见图1。
3.2DYS对32D细胞增殖的影响另采用依赖IL-3生长的32D细胞，证实了DYS促细胞增殖的作用。32D细胞在缺乏IL-3培养条件时，细胞增殖明显受抑制，但在含IL-3的培养条件下，32D细胞增殖明显，证实32D细胞依赖IL-3生长；在不含IL-3的培养条件下加入DYS（10mg・L-1）后，32D细胞数量明显增加，并呈时间依赖，此结果与在Baf3细胞中观察到的结果一致，见图2。
32D细胞依赖IL-3生长，加入IL-3后，细胞快速增殖并聚集成簇，形成明显的细胞团，该成簇生长的特征反映了32D细胞增殖的最佳状态。通过32D细胞加入IL-3后成簇生长的特征，评价了DYS单独促32D细胞增殖的能力。对照细胞在缺乏IL-3或DYS的条件下，细胞逐渐死亡，在培养第9天，仅有单个散在的活细胞存在，且数量非常有限；而加入DYS的细胞明显聚集成簇，与IL-3加入后形成的细胞团相同，但聚集成簇的细胞团略小于加入IL-3的细胞，此结果进一步证实了DYS的促造血生长作用，见图3。
3.3DYS对32D细胞分化的影响为了证实DYS诱导巨核细胞分化的作用，在缺乏IL-3的培养条件下，采用20mg・L-1的DYS单独处理细胞，在第4天和第9天经Giemsa染色，见图4，结果显示：与培养第4天的对照细胞相比，DYS单独处理细胞后第4天，多倍体巨核细胞数量增加，且胞体变大；培养至第9天细胞大部分死亡，仅剩胞体变大的细胞。经Giemsa染色并记录不同倍体巨核细胞的百分率，结果显示：在缺乏IL-3的条件下培养9d，2N细胞几乎全部死亡，4～32N巨核细胞数明显增加，DYS处理细胞中的4N细胞明显减少，但8～32N细胞明显增加，其中16N细胞增加尤其明显，为对照细胞的2.3倍。此结果初步证实地榆具有促进巨核祖细胞成熟分化的作用，见图5。
3.4DYS对Baf3细胞mIL-3受体表达水平的影响Baf3细胞表达mIL-3受体并依赖IL-3生长，DYS是否能上调mIL-3受体的表达，值得进一步研究。采用RT-PCR技术，研究了地榆总皂苷对IL-3受体mRNA表达水平的影响，结果显示，DYS单独处理Baf3细胞48h后，IL-3受体mRNA水平明显增加，但72h后下降至对照水平，见图6。
3.5DYS对32D细胞c-kit表达水平的影响c-kit为干细胞因子受体，在巨核祖细胞向成熟分化过程中发挥了重要作用。因此，进一步检测了DYS对32D细胞的c-kit表达的影响。与对照细胞比较，DYS单独处理细胞后能明显上调c-kit的表达，此结果提示地榆总皂苷也能通过上调巨核祖细胞c-kit表达而发挥促巨核细胞增殖和分化的作用，见图6。
4讨论
前期研究发现地榆总皂苷能单独或增强TPO刺激的Baf3/Mpl细胞增殖，且能显著增加TPO受体表达水平。Baf3/Mpl细胞源自于Baf3细胞，前者通过转入TPO受体Mpl后依赖TPO因子生长。本研究中，采用了无外源性Mpl表达并依赖IL-3生长的Baf3细胞以及依赖IL-3生长的32D细胞，评价了地榆总皂苷的促造血增殖作用。在缺乏IL-3的条件下，地榆总皂苷能明显促进Baf3细胞和32D细胞增殖，表明DYS可不依赖TPO和IL-3而促进巨核祖细胞的增殖。此外，延长DYS处理32D细胞的时间，可明显增加16～32N巨核细胞数量，证实DYS单独处理细胞不仅可促其增殖，而且具有促其向巨核细胞成熟分化的作用。
早期认为，巨核细胞增殖以及分化成熟主要受巨核细胞祖细胞集落刺激因子（MK-CSF）和促血小板生成素（TPO）的双水平调节。随后对小鼠和人类巨核细胞的体外研究表明，巨核细胞生成受多种体液因子的多水平调节，包括IL-3，IL-6和EPO细胞因子。近来研究证实，在造血干细胞和祖细胞中，干细胞因子（SCF）及其受体c-kit对巨核细胞增殖、分化和产生血小板的影响较其他细胞更为显著[3-4]。DYS促进巨核祖细胞增殖以及分化的作用可能与其他受体如IL-3受体和c-kit有关。据此，进一步在mRNA水平研究了DYS对2种受体表达的影响，结果发现DYS确能上调2种受体的表达。
IL-3受体属于Ⅰ型造血细胞因子受体超家族[5]，由特异性α链和β链构成，其α链与IL-3结合形成低亲和受体异二聚体，随后与β链结合形成高亲和受体复合物，导致β链的磷酸化并激活相应的信号转导途径[6-8]。IL-3受体主要在骨髓细胞中表达，与IL-3结合后可促进多种造血细胞增殖，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨核细胞、红细胞以及B细胞[9]。本研究发现DYS在无外源性IL-3的作用下可促进需依赖IL-3生长的2种巨核细胞增殖，同时上调细胞IL-3R的表达，这提示DYS可能具有拟IL-3的作用，包括促进巨核细胞等多种造血细胞的增殖及成熟。另有研究表明，IL-3不仅可直接作用于造血细胞，还可通过协同干细胞因子（SCF）及其受体c-kit，经一系列反应激活下游信号转导通路，从而调节骨髓巨核细胞的增殖与分化。且多篇文献报道，激活SCF-c-kit通路在抗肿瘤药物损伤后的造血恢复过程中可表现出良好的血小板恢复作用[3-4]。由此推测DYS对IL-3R和c-kit表达水平的上调是其发挥促巨核祖细胞增殖和分化的重要机制之一。同时，结合前期研究结果，DYS可不依赖TPO或IL-3而促进Baf3/Mpl，Baf3，32D细胞生长，表明DYS具有明显的多效细胞因子作用。由于本研究中DYS为地榆总皂苷提取物，DYS中除含有地榆皂苷I单体成分外，尚含有多种其他成分，进一步区分DYS中皂苷及非皂苷类成分的作用，尤其研究不同单体成分对巨核祖细胞增殖及分化的作用将具有更为重要的价值和意义。
[参考文献]
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