药物的亲脂性或疏水性影响着药物在细胞膜的渗透性，油水分配系数和平衡溶解度是反映药物脂溶性的2个不可或缺的重要理化参数，这2个重要理化参数对研究药物的体内过程和指导临床用药具有重要的意义[1-3]。
[摘要]目的：测定白头翁皂苷D的油水分配系数及其在不同溶剂中的平衡溶解度。方法：采用摇瓶法与高效液相色谱法相结合测定白头翁皂苷D的油水分配系数，采用高效液相色谱法测定白头翁皂苷D在6种有机溶剂及不同pH缓冲液中的平衡溶解度。结果：白头翁皂苷D在不同pH条件下油水分配系数大于零，随着pH升高白头翁皂苷D的平衡溶解度逐渐增加，在不同溶剂中白头翁皂苷D的平衡溶解度以甲醇最大（达到255.89g・L-1），乙腈中最小（0.20g・L-1）。结论：在胃肠生理条件下，白头翁皂苷D以分子状态形式存在，由lgPapp可知其吸收性较好，但水溶性较差，提示增加白头翁皂苷D的溶解度可能有利于提高其生物利用度。
[关键词]中国全科医学杂志投稿,HPLC,白头翁皂苷D,油水分配系数,平衡溶解度
白头翁皂苷D[4]（PulsatillasaponinD，PSD）是从白头翁中分离出来的一种常春藤皂苷，对HL-60肿瘤细胞和LLC肿瘤细胞具有很强的抑制作用[5-6]，笔者前期研究亦发现其对人肝癌细胞SMMC-7721、人结直肠腺癌细胞HCT116等肿瘤细胞具有较强的活性，说明白头翁皂苷D具有成药性的可能。由于白头翁皂苷D的平衡溶解度和表观油水分配系数未见相关报道，同时，为了进一步开展白头翁皂苷D体内吸收过程及剂型研究，本文通过对白头翁皂苷D平衡溶解度和表观油水分配系数的测定以期为白头翁皂苷D剂型合理选择及药动学研究提供参考。
1材料
白头翁皂苷D对照品（中药固体制剂制造技术国家工程研究中心对照品室提供，经MS，NMR鉴定、HPLC测定，纯度在99%以上）；甲醇（上海振兴化工一厂，色谱纯）；磷酸二氢钠（汕头市西陇化工厂有限公司）；正辛醇（汕头市西陇化工厂有限公司，分析纯）；其他试剂均为分析纯。
高效液相色谱仪：Agilent1260色谱泵，二级管阵列检测器（DAD），美国安捷伦科技公司；KQ-4000B型超声清洗机（巩义市予华仪器有限责任公司）；AL204电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；TDL-40B飞鸽牌台式离心机（上海安亭科学仪器厂制造）；HH-2数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；SHZ-82气浴恒温振荡器（常州国华电器有限公司）；MilliporeSynergy超纯水系统（美国密理博公司）。
2方法与结果
2.1样品的制备
2.1.1正辛醇水饱和液的制备精密吸取200mL正辛醇至500mL具塞锥形瓶，加水200mL，置磁力搅拌器上，搅拌24h，静置，备用。
2.1.2不同pH缓冲液的制备按《中国药典》（2010年版二部）附录ⅩⅤD缓冲液的配制方法，分别配制pH为2.0，5.0，5.8，6.8，7.0，7.6的磷酸盐缓冲液[7]。另称取氯化钠2g、量取浓盐酸7mL至1000mL量瓶中，加水稀释至刻度配成pH1.2的缓冲液。
2.1.3对照品溶液的制备精密称取白头翁皂苷D对照品（五氧化二磷减压干燥24h）13.6mg，置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成0.544g・L-1的对照品溶液。
2.2白头翁皂苷D的含量测定
2.2.1检测波长的选择取白头翁皂苷D对照品溶液，以甲醇为空白样品，采用紫外分光光度法在190～400nm进行全波长扫描，白头翁皂苷D在203nm处有最大吸收，因此选择203nm作为白头翁皂苷D的检测波长。
2.2.2色谱条件与系统适用性试验Agilent1260，大连依利特HyperisilODS2C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相甲醇-水-甲酸（75∶25∶0.1），流速1.0mL・min-1，柱温30℃，紫外检测波长203nm。理论塔板数按白头翁皂苷D计算不低于3000，分离度大于1.5，色谱图见图1。
2.2.3线性关系考察取白头翁皂苷D对照品溶液液（0.523g・L-1），分别进样1，2，5，10，15，20μL。按2.2.2项下色谱条件进行测定，分别记录白头翁皂苷D的峰面积。以进样浓度（Y）为横坐标，峰面积（X）为纵坐标作图并进行线性回归，得线性方程Y=3320.1X-8.9146，r=0.9999（n=6），结果表明白头翁皂苷D进样质量浓度在0.0523～1.0460g・L-1呈良好线性关系。
2.2.4精密度试验精密吸取白头翁皂苷D对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，每次进样10μL分别记录峰面积，结果RSD1.6%，说明该方法精密度良好。
2.2.5稳定性试验取已知不同表观油水分配系数及不同溶剂下的供试品溶液，分别在0，1，2，6，12，24h条件下取样，按上述色谱条件进样10μL进行检测并记录峰面积，结果RSD均小于2%，表明所有供试品溶液在24h内基本稳定。
2.3白头翁皂苷D表观油水分配系数的测定
精密称取白头翁皂苷D样品0.0264g，置50mL水饱和的正辛醇溶液，超声溶解，离心15min（4000r・min-1），备用。精密吸取含白头翁皂苷D的水饱和正辛醇2mL，置10mL具塞塑料管中，分别加入2mL正辛醇饱和水及不同pH的磷酸盐缓冲液，将具塞塑料管放入恒温振荡器中，控制温度（25±1）℃，振摇72h直至平衡，4000r・min-1离心10min，取上层正辛醇溶液，按照上述色谱条件进样10μL进行测定，记录峰面积。分别计算其浓度，并按下式计算表观油水分配系数。Papp=（CV-CwVw）/CwVw，式中Papp为白头翁皂苷D的表观油水分配系数；C为正辛醇中白头翁皂苷D的初始浓度，V为水饱和正辛醇的体积（即2.0mL）；Cw为分配平衡时白头翁皂苷D在水相中测得的浓度，Vw为水相体积（即2.0mL）。按照公式计算不同pH磷酸盐缓冲溶液中表观正辛醇/缓冲溶液分配系数，结果见表1。结果显示，pH在1.2，5.0，6.0，6.8，7.0，7.6时，其lgPapp均大于零，可以预测在此pH条件下该化合物亲脂性较强，当pH为6.8时其Papp为7.48，lgPapp=0.87，说明在此pH条件下有利于吸收。
2.4白头翁皂苷D溶解度的测定
取过量白头翁皂苷D于10mL具塞试管中，分别加以下2组介质5mL：①有机溶剂组，包括乙醇、甲醇、乙腈、丙酮、正丁醇、二氯甲烷；②缓冲溶液组，pH分别为1.2，2.0，4.0，5.8，6.8，7.6，于25℃空气振荡器中振摇，分别在不同时间点取样，1万r・min-1离心15min后，根据线性范围采用甲醇对样品进行适当稀释，按上述色谱条件进样10μL，记录峰面积，计算白头翁皂苷D在各介质中的含量，并计算其在不同介质中的平衡溶解度。结果见图2，3。
由图2可知，白头翁皂苷D在不同pH缓冲溶液中随着pH不断升高，溶解度逐渐增加，当pH为7.6时，其平衡溶解度达到0.38g・L-1；由图3可知，白头翁皂苷D在不同介质中的平衡溶解度以甲醇为最大，达到255.89g・L-1，在乙腈中最小仅为0.20g・L-1。
3讨论
根据白头翁皂苷D的分子结构可知，白头翁皂苷D在碱性条件下易形成盐，会改变其溶解性，从而导致测定结果不准确，故选择在不同消化道的生理pH条件下测定其表观溶解度及油水分配系数。
油水分配系数测定的方法有摇瓶法、产生柱法以及高效液相色谱法[8-13]。由于产生柱法测定过程繁杂、平衡时间太长，反相高效液相色谱法需采用已知P值的同系物对照品来建立标准曲线，费用高，而经典的摇瓶法操作简单、成本低[14]，所以采用摇瓶法测定白头翁皂苷D的油水分配系数。此外，因白头翁皂苷D的分子结构中具有五环三萜类的母核使其具有较高的脂溶性，而分子中又含有1个由3个单糖组成的糖链和母核上连结的羧基又使其具有一定的水溶性，故在油水分配体系的选择过程中，应选择更接近生物相、极性和溶解性均较好的正辛醇为油相[15]。所以，本实验选用正辛醇-水系统作为其最佳油水分配体系。
在测定白头翁皂苷D的平衡溶解度过程中，本实验主要根据不同时间点样品浓度变化和试管壁上附着过量的白头翁皂苷D为指标，确定白头翁皂苷D是否达到平衡。由白头翁皂苷D在不同介质中的平衡溶解度可知，白头翁皂苷D溶解性较差，难以有效地被机体吸收，从而导致其生物利度较差。白头翁皂苷D在不同缓冲盐溶液中随pH升高其溶解度不断增加，这可能与其结构上含有羧基有关，白头翁皂苷D在碱性条件下易形成盐，并随着碱盐增加其溶解度升高，故可以考虑通过让其形成盐提高溶解度，从而提高生物利用度。
根据本实验对白头翁皂苷D平衡溶解度及油水分配系数的测定结果可知其水溶性较差，根据文献，药物lgPapp在-1～1时药物吸收较好[16]，该结果说明机体对白头翁皂苷D的吸收性较好。按照BCS（biopharmaceuticsclassificationsystem）分类可知，白头翁皂苷D属于低溶解度、高透过性的药物，所以，研制白头翁皂苷D口服制剂的关键在于增加药物在体内的溶出度，进而有利于提高其生物利用度。
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