川芎LigusticumchuanxiongHort.为伞形科藁本属多年生草本植物，以根茎入药，味辛、性温，具有活血行气、祛风止痛等功效[1]。川芎的主要药效成分包括阿魏酸、总生物碱、内酯类化合物、挥发油和酚性成分等物质[2-3]。
[摘要]该文建立了HPLC同时测定川芎药材中阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯含量的方法。用40%乙醇提取样品中的药效成分，采用SymmetryC18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，0～5min，乙腈-甲醇-1%冰醋酸（20∶40∶40），5～30min，乙腈-甲醇-1%冰乙酸（60～100∶0∶40～0）为流动相，流速lmL・min-1，检测波长0～4.3min，321nm，4.31～30min，275nm，柱温35℃，进样体积10μL，应用安捷伦1100系列液相色谱仪进行测定。5种药效成分的分离效果良好，在相应的浓度范围内与峰面积有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，加样回收率（n=6）均在94.44%～103.1%。该方法应用于研究都江堰产区（海拔600m左右）不同采收期对川芎阿魏酸和4种内酯类物质含量的影响，试验在4月15日（栽后245d）至5月30日（290d）内设置了10个采收期，发现5种药效成分的含量与采收期（栽后天数）均呈二次或三次函数关系，随着采收期的推迟而先增后减，阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯的含量在栽后260～265d（4月30日至5月5日）最高。
[关键词]药剂师论文投稿,川芎,HPLC,采收期,含量
目前川芎的质量评价主要以《中国药典》2010年版（一部）的质量规范为标准，对川芎性状、阿魏酸的含量（≥0.1%）、水分（≤12%）、总灰分（≤6%）、酸不溶性灰分（≤2%）、浸出物（≥12%）做了相关规定[1]。仅以阿魏酸一种药效成分来评价川芎品质的高低有失偏颇，作者一致认为加之其他药效成分综合评价更为合理。如今测定阿魏酸单一成分含量的方法较多[4-9]，也有单一测定藁本内酯的方法[10]，或阿魏酸与川芎嗪、阿魏酸与藁本内酯2种成分同时测定的方法[11-12]，还有一些有关成分测定和川芎指纹图谱建立的方法[5-6，13-16]，总之，这些方法只是单一成分及少数成分的定量测定，或是指纹图谱中没有确定具体成分、结构及药效作用，只是对所测的材料确定了共有峰的数量及相对面积大小（不能代表药材中的真实含量），且存在耗时较长和溶液消耗较多的缺点，均不利于对川芎药材品质的综合评价，需要建立一套能同时测定多种药效成分的快捷、高效而可靠的分析方法，以便全面、正确地综合评价川芎药材的品质。
另外，不同的采收期对川芎的品质影响较大，蒋桂华和饶凡[17-18]等对川芎的采收期有过研究，遗憾的是其涉及的采收期较少或只测定阿魏酸、生物碱和挥发油3个指标的含量，不足以筛选川芎的最适采收期；近年来，随着种植结构和耕作制度的改变，川芎的收获期逐渐提前，位于四川彭山县的川芎产区也是杂交水稻的制种区，为保证制种水稻提前栽秧，川芎的采收期提前到了4月上中旬；位于都江堰和彭州市的川芎主产区，主要实行的是川芎-水稻轮作制，为了提高水稻产量，所选用水稻品种的生育期呈延长之势，也在一定程度上影响了川芎的适时收获。因此，系统研究川芎采收期特别是早收对川芎品质的影响可为川芎的生产提供理论依据。
本文建立了HPLC同时测定川芎药材中阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯含量的方法，为川芎药材及相关产品的品质评价提供新的方法参考，同时研究川芎采收期对川芎品质的影响对川芎的优质高产栽培及川芎-水稻轮作制度有重要意义。
1材料
安捷伦1100LC系列液相色谱仪，ChemStation化学工作站、VWD检测器；CAP225D电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司），SB-5200DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
试验材料培养于川芎药材采收期试验田，川芎苓种来自都江堰市三江镇，2011年8月10日栽种在都江堰市石羊镇广益村试验田，土地平整，地力均一，pH为5.83，碱解氮58.34mg・kg-1，速效磷114.27mg・kg-1，速效钾42.31mg・kg-1，有机质23.82g・kg-1。试验采用单因素随机区组设计，设置10个采收期，分别为2012年4月15日（栽后245d，下同）、2012年4月20日（250d）、2012年4月25日（255d）、2012年4月30日（260d）、2012年5月5日（265d）、2012年5月10日（270d）、2012年5月15日（275d）、2012年5月20日（280d）、2012年5月25日（285d）和2012年5月30日（290d）。重复3次，共30个处理，试验小区面积为20m2。施肥[19]、密度[20]及其他栽培管理措施保持小区间一致。
甲醇（HPLC级）和乙腈（HPLC级）购买于赛默飞世尔科技股份有限公司，乙醇（HPLC级）和冰乙酸（AC级）购买于成都科龙化工试剂厂，超纯水由娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）代替，标准对照品阿魏酸和藁本内酯购买于中国食品药品检定研究院，洋川芎内酯I、洋川芎内酯H和洋川芎内酯A购于四川省中药标准中心。
2方法与结果
2.1色谱条件
SymmetryC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为0～5min，乙腈-甲醇-1%冰醋酸（20∶40∶40），5～30min，乙腈-甲醇-1%冰乙酸（60～100∶0∶40～0）；流速lmL・min-1；检测波长0～4.3min，321nm，4.31～30min，275nm；柱温35℃，进样体积10μL。2.2对照品溶液的制备
分别准确称取阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯等5种对照品32.000，50.000，50.000，50.000，100.000mg，用甲醇定容到100mL，摇匀，即得对照品储备溶液。分别准确吸取一定量的上述储备液于10mL量瓶中，用40%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得到0，3.2，6.4，12.8，19.2，25.6，32.0，64.0mg・L-1的阿魏酸对照品溶液0，25，50，100，200，300，400，500mg・L-13种洋川芎内酯（I，H和A）对照品溶液和0，0.050，0.100，0.200，0.300，0.400，0.500，1.000g・L-1的藁本内酯对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备
2.3.1回流提取法取川芎样品0.5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入40%乙醇50mL，称重，加热回流提取30min，放冷，再称定质量，用40%乙醇补足失重，摇匀，静置，取上清液，滤过，续取滤液，0.45μm微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，见图1。
2.3.2超声提取法取川芎样品0.5g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入40%乙醇50mL，称重，超声提取30min（200W，40℃），放冷，再称定质量，用40%乙醇补足失重，摇匀，静置，取上清液，滤过，续取滤液，0.45μm微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，见图1。
结果表明加热回流法与超声波法对提取川芎药材中的阿魏酸和洋川芎内酯H的含量差异显著，超声法提取效果更佳，其余3种内酯类物质的含量差异不显著，由于超声波法对药效成分的提取操作更加简便，且效率更高，在工作过程中放出的热量更少，故本文选用超声波优化提取法[21]作为提取川芎药材中上述5种主要药效成分的方法。
2.4方法学考察
2.4.1线性关系精密吸取2.2项下稀释的对照品标准溶液10μL注入液相色谱仪，平行测定3次，取平均峰面积。以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线并进行回归计算，得到阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯的回归方程分别为Y=73.630X+1.888（R2=1.000），Y=33.922X-4.682（R2=0.999），Y=6.117X-3.739（R2=0.999），Y=4.664X+0.493（R2=0.999）和Y=9469.800X+4.622（R2=0.999），分别在0.049～64，0.785～500，2.334～500，0.188～500，0.025～1000mg・L-1线性关系良好。
2.4.2精密度试验精密吸取2.3.2项下提取的川芎样品溶液10μL，连续进样8次，测得上述5种药效成分的峰面积RSD均小于2%，表明仪器具有良好的精密度。
2.4.3重复性试验取同一批川芎样品6份，按2.3.2项下方法制备样品溶液，吸取10μL注入液相色谱仪，结果显示上述5种药效成分峰面积的RSD分别为1.8%，0.90%，0.30%，0.44%，1.1%，表明超声法提取重复性良好。
2.4.4稳定性试验取同一样品溶液，室温放置，并分别于0，1，2，4，12，24，48h进行测定，结果显示上述5种药效成分峰面积RSD均小于1.6%，表明样品溶液在48h内稳定。
2.4.5回收率试验精密称取已知含量的样品0.5g，共6份，精密称定并加入阿魏酸0.46mg、洋川芎内酯（I，H和A）和藁本内酯各0.5mg，按2.3.2项下方法制备样品，加样回收率按如下公式计算：回收率（%）=（测得量-样品中量）/加入量×100。结果显示上述5种药效成分的平均加样回收率，见表1，分别为103.1%，94.44%，96.61%，97.55%和95.22%。
2.5样品测定
分别取不同采收期的川芎样品，按2.3.2项下方法制备样品溶液，按2.1项下色谱条件测定，利用已建立的标准曲线计算样品中的阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯含量，见图2。
10次采收期样品的平均阿魏酸质量分数为2.51mg・g-1，在260d时采收的样品质量分数最高，为2.94mg・g-1，比平均含量高17.1%，显著高于除255d之外的其他8个采收时期，与255d采收的川芎阿魏酸含量差异在0.05水平时不显著，在245，285，290d采收的阿魏酸含量最低，分别比平均含量低21.8%，4.1%，12.1%，而最高含量比最低含量高出了42.7%。洋川芎内酯Ⅰ的平均质量分数为0.58mg・g-1，270d时采收的样品质量分数最高，达0.70mg・g-1，比平均含量高20.69%，显著高于其他各采收期的含量，290d采收时的洋川芎内酯Ⅰ质量分数最低，仅0.44mg・g-1，比270d时采收的样品含量低59.1%。245，260d时采收的样品洋川芎内酯H质量分数最高，分别为2.19，2.15mg・g-1，在α=0.05水平时与其他各采收期的样品含量差异显著，除245d采收的样品外，随着采收期推迟其含量呈先增加后降低的现象，290d采收时的洋川芎内酯H质量分数最低，仅1.25mg・g-1，比260d采收的样品含量低67.8%。洋川芎内酯A和藁本内酯的质量分数均在260d采收时最高，分别为15.21，31.35mg・g-1，与其他各采收期样品的含量差异显著，290d采收时其含量均最低，分别比最高含量低63.0%，35.0%。随着采收期的推迟，川芎药材中5种主要药效成分的含量呈先增加后减小的变化趋势，其含量与采收期均呈二次或三次函数关系，并建立了相关的数学模型。通过上述5种药效成分的含量与采收期的数学模型可知，早收和晚收均不利于提高川芎药材的品质，255～270d期间采收川芎药材的阿魏酸、洋川芎内酯I和藁本内酯的含量最高，250～260d期间采收川芎药材的洋川芎内酯H和洋川芎内酯A的含量最高。综合上述5种主要药效成分含量和实际生产情况的角度来分析，260～265d为最佳采收时期，此时川芎生长最旺盛，随后开始逐渐衰老，药效成分的含量慢慢降低。
3讨论
3.1HPLC同时测定川芎5种药效成分含量的方法
中药材的质量评价正向快速、高效、样品前处理简单、高重复性、低成本、容易操作的方向发展。HPLC是中药材及中药饮片品质评价常用的方法，在川芎上常被用于构建指纹图谱[5-6，13-16]来评价不同产地和不同品种的药材的品质，但一般没有具体药效成分的含量；也有一些测定阿魏酸、川芎嗪、挥发油、香草醛、内酯类等单一成分或其中2～4种成分测定方法方面的报道[4-12]，由于同时测定的成分少，测定的效率不高，至今鲜见同时测定阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯等多种成分方面的研究。
同时对色谱溶剂（乙腈和甲醇）与不同浓度的乙酸和水组成的流动体系（甲醇-水、甲醇-乙酸、乙腈-水、乙腈-乙酸和甲醇-乙腈-乙酸等）、柱温（25，30，35，40，45℃）和流速（0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2mL・min-1）等单变量（因素）试验，优化出了HPLC同时测定阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯含量，即选用流动相为0～5min，乙腈-甲醇-1%冰醋酸（20∶40∶40），5～30min，乙腈-甲醇-1%冰乙酸（60～100∶0∶40～0），流速lmL・min-1，检测波长0～4.3min，321nm，4.31～30min，275nm，柱温35℃，进样体积10μL。本文通过对测定方法的考察，建立了高重复性、快速的川芎药材中主要药效成分含量的测定方法且线性、精密度、重复性和回收率均良好，洗脱时间仅为30min同时测定川芎药材中5种重要的药效成分，大大的提高了工作效率，同时也降低了测定成本，且所测定样品的药效成分含量与之前报道的结果一致[5，7-8，16，22-24]，所以本测定方法可以全面应用于川芎药材的品质评价。
3.2采收期对川芎5种药效成分含量的影响
川芎的品质不仅因产地[10]、品种而异，也受耕作方式[25]、施肥技术[22-24]等生产技术的影响。蒋桂华[17]、饶凡[18]等研究认为采收期对川芎的品质也有较大影响，但前者研究的时期是5月20日及其前后10d共3个时期，且结果在年度和地点不尽一致；而后者研究的时间从头年12月至次年6月，时间间隔过大，对生产上主要采收时间（5月上旬至中旬）分析不够。本文采用单因素随机区组试验方法，从4月15日（245d）起每5天采收1次直至5月30日（290d）止，共10个采收期，采用上述建立的方法，分析了都江堰产区（海拔600m左右）每个采收期样品的阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯共5种药效成分的含量，并建立了其与采收期的回归关系，发现采收期对这5种成分均有显著影响，随着采收期的推迟，5种药效成分的含量均呈现先增后减的趋势，采收过早过晚都会降低各药效成分的含量，综合考虑阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A和藁本内酯的含量，确定最佳采收期为4月30日（260d）至5月5日（265d）。
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