HPLC测定不同月份枸杞叶中芦丁含量

　　摘要：为了控制和测定枸杞叶的黄酮含量，建立HPLC测定芦丁的方法。采用PhnomenexC18（2.5×150mm），流动相为甲醇，0.1%磷酸水，流速1.0ml/min，检测波长为254nm,外标法定量。结果表明该方法稳定，枸杞叶芦丁含量9月份达到最高，8月份的含量次之。
　　关键词：枸杞叶；黄酮；HLPC
　　枸杞叶，又称为天精草，为常用的传统中药，其有效成分主要为黄酮类化合物[1]。研究发现黄酮类成分具有止咳、平喘、祛痰之功效，并能扩张冠状动脉及降低血胆固醇，有增强心脏收缩、减少心脏搏动数及明显的抗氧化等作用[2-5]。供试枸杞叶分别于5月、6月、7月、8月、9月和10月中旬采自青海省都兰的同一批枸杞枝条，海拔3800m，经卢学峰和梅丽娟两位高级工程师鉴定为宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)。全株自然阴干，粉碎后备用。
　　1、仪器与设备
　　1.1仪器：美国Agilent1200型高效液相色谱仪[四元梯度泵，DAD检测器，Agilent1200色谱工作站]；AG204电子分析天平；KQ2250DB型数控超声提取仪；RT29型中药粉碎机；超纯水机。
　　1.2试剂：色谱用甲醇为色谱纯；纯净水为18.25兆欧的超纯水；提取用甲醇，H3PO4均为分析纯。芦丁对照品购自中国药品生物制品检定所,纯度大于98%。
　　2、方法与结果
　　2.1色谱条件：色谱条件为PhnomenexC18（2.5×150mm）柱，流速为1.0ml/min，柱温为25℃，检测波长254nm，流动相A为甲醇，B为0.1％磷酸溶液，0-20min，45%A；20-30min，45A-65％A。标准品及样品色谱图分别见图1。
　　
　　图1a供试溶液的色谱图b芦丁对照品的色谱图
　　2.2对照品溶液的制备：分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的芦丁对照品7.0mg，溶解于10ml的容量瓶中，既得0.7mg/ml的溶液，摇匀，0.45μm的微孔滤膜过滤后作为对照品溶液。
　　2.3供试溶液的制备：不同时间采集的枸杞叶样品各取约1g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇25mL，超声提取20分钟，过滤，定容至50ml的容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，既得。
　　2.4标准曲线及线性范围：精密吸取对照品溶液2，4，6，8，10μL，在2.1项色谱条件下依次进样，以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得芦丁的线性回归方程：Y=2454.632X-32.12，r=0.9999。
　　2.5稳定性试验：取枸杞叶按照2.3项下方法配制成溶液,分别在0、3、6、9、12h后在上述色谱条件下进样，结果芦丁的面积RSD为0.81%，表明样品在12小时内稳定。
　　2.6精密度试验：取2.5项下枸杞叶溶液，连续进样5次，结果槲皮素的峰面积的RSD为0.84%，说明该实验的精密度良好。
　　2.7重复性试验：精密称取枸杞叶样品1共5份，每份1.0g，分别按照2.3项下方法配成溶液，精密吸取10μL进样分析，芦丁的峰面积RSD为1.53%(n=5)，说明该方法重复性较好。
　　2.8加样回收率试验：精密称取已知芦丁含量的枸杞叶药材5份，每份1.0g，加入对照品溶液，制备样品溶液。精密吸取10μL进样分析，计算平均加样回收率，结果见表1。
　　表1加样回收率
　　测定成分 样品含量（mg/g） 加入量（mg） 测得量/（mg/g） 回收率（%） RSD（%）
　　芦丁 1.2 1 2.17 98.6% 1.6
　　2.9样品含量测定：分别精密吸取样品溶液和混合对照品各10μL，注入高效液相色谱仪中，按2.1项下色谱条件测定，测定峰面积积分值，按外标法计算样品溶液中芦丁含量，结果见表2。
　　表2不同月份黄酮含量
　　月份 黄酮含量（mg/g）
　　5 1.2
　　6 1.4
　　7 1.8
　　8 3.0
　　9 3.2
　　10 2.5
　　3、讨论
　　考虑了甲醇、乙醇作为溶媒进行提取溶剂的选择(无水乙醇、60%甲醇、80%甲醇、甲醇)，并对不同提取时间(20，30，40min)和不同提取方法(超声、回流及微波)进行比较，结果显示甲醇20min超声提取效率最高，且槲皮素和山奈酚测得含量高。
　　
　　图3不同月份枸杞叶芦丁含量变化
　　从图3可以看出随着枸杞叶采集月份不同，其芦丁含量呈明显的先增加后减弱的趋势，而且9月份枸杞叶的芦丁含量最高，这为枸杞叶的采摘提供了理论基础。即该类地区枸杞叶自4月底、5月初出芽后，持续生长约至10月便会变黄脱落，继而新发第二批叶片，因此，采自9月中旬的枸杞叶，其中次生代谢物的含量积累量达到一个新的高度。通过对不同采收期枸杞叶中芦丁含量的动态变化规律研究可以为枸杞叶药材的产地选择及最佳采收期的确立提供一定的数据参考，也为进一步开发枸杞叶的药用功能和扩大黄酮类药物的药源提供一定的依据。
　　参考文献
　　[1]肖崇厚．中药化学[M]．上海：上海科学技术出版社，1996．265．
　　[2]张颖，张立睦，周红英，等．不同产地枸杞子中黄酮含量的测定[J]．中国中医药科技，2004，11(2)：102-103．
　　[3]李国莉，黄元庆．宁夏枸杞不同组分黄酮含量分析[J]．宁夏医学院学报，1995，17(2)：114-115．
　　[4]苑可武，孟宪惠，徐文豪．银杏叶中黄酮含量的季节性变化[J]．中草药，1997，28(4)：211-212．
　　[5]施荣富，王春红，李永海．沙棘叶黄酮含量及变化规律研究[J]．国际沙棘研究与开发，2003，1(1)：40-44．
　　作者简介：吴桂玲，女，1983年生，青海乐都人，硕士研究生，助理研究员，主要从事农产品分析检测工作。