【摘 要】目的：研究雄鼠睾丸Clock基因沉默后，小鼠体外受精的变化及机制。方法：通过在ICR小鼠睾丸内注射Clock干扰质粒(实验组)和HK阴性对照质粒(对照组)，注射18天后收集雄鼠精子，计数精子浓度，前向运动精子百分率和精子总活率。再将孵育好的精子加入卵培养皿中，分别观察卵丘颗粒细胞驱散情况及卵裂情况，计算受精率、囊胚生成百分率和胚胎孵化率。结果：睾丸Clock基因沉默后，小鼠精子活动率及前向运动率较对照组降低(p<0.05)，实验组精子驱散卵丘颗粒细胞能力的时间延长(p<0.001)。结论：睾丸clock基因可影响精子驱散卵丘颗粒细胞的能力，该机制在Clock基因影响小鼠生殖的过程中的作用有待进一步研究。
【关键词】医师论文发表,Clock基因,精子,体外受精,前向运动,受精率
0 引言
近日节律在生物的生殖和发育过程中发挥重要作用[1]。Clock基因是近日节律系统的核心成分，它在哺乳动物的生殖器官有表达，如子宫[2]，输卵管 [3]和睾丸[4]等。研究发现Clock基因突变可引起动物生殖能力变化，如L.M.Beaver等发现果蝇睾丸和精囊中的精子数量下降，雄性生育能力降低[5]。通过前期研究，我们发现干扰睾丸Clock基因的表达引起小鼠胎仔数下降[6]，小鼠的生殖能力降低[7]。但Clock基因引起其生殖能力下降这一现象的机制一直未明了，本研究通过向小鼠睾丸注射Clock干扰质粒沉默Clock基因，观察精子运动和体外受精的变化，以进一步探究Clock 基因影响小鼠生殖的机制[8]。
1 材料和试剂
1.1 实验动物
实验中雄性ICR小鼠8-10周，雌性ICR 小鼠4-6周，均饲养于光暗各12h的循环箱内，自由进食和饮水;将雄性小鼠20只随机分为实验组和对照组2组，每组10只，实验组在睾丸内注射 Clock干扰质粒，对照组在睾丸内注射HK阴性质粒。雌鼠10只，每组5只(雌雄比，雌：雄=1：2)。雌雄分开饲养。
1.2 试剂
质粒：Clock干扰质粒(武汉晶赛公司);HK阴性对照质粒(武汉晶赛公司);OMEGA质粒提取试剂盒;孕马血清促性腺激素(PMSG);绒毛膜促性腺激素(HCG);HTF培养液;HEPES-HTF培养液;卵裂培养液;囊胚培养液;血清蛋白代用品(SPS);动物体内转染试剂In vivo-jetPEITM(Poly Plus)。
2 实验设计
2.1 实验处理
雄性小鼠乙醚麻醉。实验组：用微量注射器将20μlClock干扰质粒注射入小鼠的双侧睾丸里。对照组：用微量注射器将20μlHK阴性对照质粒注射入小鼠的双侧睾丸里。注射质粒18天后，手术法收集精子并孵育精子。向雌鼠体内腹腔注射PMSG 10IU/只，同等条件下培养观察两天之后，再次向雌鼠体内腹腔注射HCG 10IU/只，培养并观察15-16h，用颈脱臼法处死小鼠。配置卵培养液待用。再将孵育好的精子浓度约为1×106/ml精子加入卵培养皿中进行体外受精及胚胎发育的观察。
2.2 结果观察
我们在注射质粒后的18天，将收集到雄鼠精子统计分析并计算其精子浓度。精子因为运动方式的不同，可分为三个等级：前向运动(A级：快速前向直线运动和B级：直线运动)、非前向运动(C级：曲线运动和D级：原地打转)、不动。针对不同视野的200个精子按照运动方式进行分级，计算前向运动精子百分率和精子活动率，以此来观察和分析精子的活动度的变化。前向运动精子百分率=前向运动精子数 /200×100%;精子活动率=(前向运动精子数+非前向运动精子数)/200×100%。
通过计算受精率、囊胚形成率和胚胎孵化率来观察ICR小鼠体外受精及胚胎发育的情况。按如下方法进行计算：受精率=卵裂胚数/卵丘-卵母细胞复合体数×100%;囊胚形成率=囊胚数/卵裂胚数×100%;胚胎孵化率=孵出胚胎数/囊胚总数×100%。
2.3 统计分析
实验数据以平均值±标准差(x±s)表示，组间均数的比较用t检验，率的比较采用Χ2检验。本研究数据均采用SPSS12.0统计软件进行分析。
3 实验结果
3.1 精子活动度
实验结果如表1，实验组和对照组的精子浓度分别为(16.77±7.65)×106/ml、(18.76±10.37)×106/ml，两组精子浓度无明显差异(P>0.05)。
表1 干扰小鼠睾丸Clock基因后精子的活动度
注：*与对照组相比，p<0.05.
实验组前向运动精子百分率为(36.09±7.54)%，精子活动率为(62.83±8.20)%;对照组前向运动精子百分率为(42.00±8.02)%，精子活动率为(69.44±9.47)%，两组差异均有统计学意义(p<0.05)，实验组前向运动精子百分率、精子活动率下降。
3.2 体外受精及早期胚胎发育
观察获能精子与成熟卵母细胞共孵育情况发现，与实验组精子共孵育的卵母细胞外卵丘颗粒细胞被驱散速度明显延迟。在共孵育5分钟时，对照组中所有卵母细胞外卵丘颗粒细胞均被驱散，而实验组中所有卵母细胞外卵丘颗粒细胞并未被驱散(表2)。
表2 体外受精后卵母细胞外卵丘颗粒细胞驱散情况
*：Χ2检验，p<0.001.
体外受精后形成的2-细胞胚胎，4-细胞胚胎。实验组的受精率为(63.66±12.60)%，对照组的受精率为(78.83±14.38)%，差异有统计学意义(p<0.05)，表明Clock基因沉默后，受精率降低。受精后第3天更换新的囊胚培养液培养至受精后第6天，观察记录囊胚的形成和孵化情况。统计结果表明，受精后，实验组囊胚的形成率、孵化率和对照组相比，均无明显差异。 表3 干扰小鼠睾丸Clock基因后其精子体外受精及
早期胚胎发育的情况
注：*与对照组相比，p<0.05
4 讨论
Clock基因是近日节律的核心基因，在CLOCK蛋白与Bmal1形成的异二聚体中发挥重要作用。我们用RNAi干扰CLOCK蛋白的表达，发现小鼠的生殖能力明显受到影响。本文进一步观察Clock基因干扰后，雄鼠精子运动能力和授精能力的变化。
精子运动能力的强弱与受精密切相关，只有正常(下转第87页)(上接第8页)前向运动的精子才可能抵达输卵管壶腹部与卵子结合形成受精卵。本研究发现 Clock基因沉默后，精子前向运动的百分率降低，在体外受精过程中，精子驱散颗粒细胞能力有所降低，提示实验组很可能影响了精子顶体反应的酶，使得其受精率降低。在精子形成过程中，发育中的顶体发现有Clock基因的表达，用RNAi干扰Clock基因的表达，小鼠睾丸CLOCK蛋白的表达明显下调，顶体酶活性明显降低。综合上述研究和本研究的结果，可以推测Clock基因通过影响顶体酶的活性，进一步影响精子驱散卵丘颗粒细胞的能力。体外受精成功后，早期胚胎形成发育过程中，囊胚的形成率和胚胎的孵化率无统计学意义，但胎仔数却明显下降。因此，睾丸Clock基因干扰可引起精子前向运动异常和驱散卵丘时间延长，影响了雄性小鼠的生殖功能，但其具体机制以及对胚胎发育的影响尚需进一步的研究。
【参考文献】
[1]王凌，崔允文.国外时间生物学进展[J].生物医学工程学杂志，2005，1：185.
[2]Johnson M H， Lim A， Fernando D， et al. Circadian clockwork genes are expressed in the reproductive tract and conceptus of the early pregnant mouse[J]. Reproductive biomedicine online，2002，4(2)：140-145.
[3]Kennaway D J， Varcoe T J， Mau V J. Rhythmic expression of clock and clock�controlled genes in the rat oviduct[J]. Molecular human reproduction， 2003，9(9)：503-507.
[4]Alvarez J D， Chen D， Storer E， et al. Non-cyclic and developmental stage-specific expression of circadian clock proteins during murine spermatogenesis[J]. Biology of reproduction， 2003，69(1)：81-91.
[5]Beaver L M， Gvakharia B O， Vollintine T S， et al. Loss of circadian clock function decreases reproductive fitness in males of Drosophila melanogaster[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2002，99(4)：2134-2139.
