骨髓间充质干细胞的研究现状

　　摘要：骨髓8间充质干细胞是存在于骨髓中的除造血干细胞以外的另外的另一类具有多向分化潜能的干细胞。在一定的诱导条件下，这类细胞可定向分化为造血系统以外多种组织细胞，特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。例如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞、神经细胞等。骨髓间充质干细胞具有贴壁生长的特性，能在体外易分离和扩增，还可用于外源基因的转入和表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。本文针对骨髓间充质干细胞的研究进展和在临床医学上的应用进行综述。
　　关键词：骨髓间充质干细胞；综述；定向引导；
　　组织工程骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCS）也称骨髓基质来源干细胞，因呈成纤维样外观，所以也称为集落形成单位成纤维细胞（colony—formingunitesfibroblasts,CFUF）,至今还没有相对统一的命名。但大量的研究表明：BMSC是可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞、腱细胞等的一种具有多项分化潜的能干细胞。在体外易分离和扩增，且便于细胞移植。此外，BMSC独特的增殖分裂模式使外源基因易于导入和表达。因此，BMSC在组织工程、细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。
　　骨髓间充质干细胞的研究历史
　　130年前，德国病理学家Cohnhein在研究伤口愈合过程中首次提出骨髓中存在充质干细胞(MSC)的观点。他是在试验中给动物静脉注射一种不溶性染料analine，然后在肢体远端人为造成损伤。结果在伤口愈合部位有含染料的细胞，包括炎症细胞与成纤维样细胞。后来由于受到条件的限制，这些研究未能继续进行。直到1976年，Friedenstein等，从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样、以贴壁生长并可形成集落的细胞群，即成纤维集落形成单位。1987年，Friedenstein等又发现在塑料培养皿中培养的贴壁骨髓单核细胞在特定的条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，并且扩增20－30代后仍保持其多向分化潜能。
　　骨髓间充质干细胞的分离与培养
　　目前，BMSC的分离纯化及体外培养方法，由于各实验室的条件不同，许多实验室仍是在Friedenstein等方法基础上进行一定的改进，即根据BMSC易于黏附塑料底物的特性来实现分离。每次更换培养基时，先吸去培养液，再用Tyrode’S平衡盐溶液冲洗2-3遍，冲去悬浮生长的造血干细胞，再加入新鲜培养基，称为贴壁筛选法；根据BMSC与其它细胞密度不同，采用细胞分离液来分离。把分离的骨髓缓慢转入细胞分离液表面，进行离心，再收获分离单核细胞进行培养，即密度梯度离心法；根据细胞大小或者细胞表面的一些特殊标志来进行分离，即流式细胞仪分选法。这一方法已商业化，分选纯度可达98%以上。用贴壁筛选法分离得到的是一个异质细胞群，含有多种其它成分。因为BMSC是一类比较脆弱的祖细胞，当经过流式细胞仪时可导致某些活性完全丢失，而用密度梯度离心法可得到形态和性质均一的BMSC。因此，目前广泛采用的是利用密度梯度离心法来分离纯化BMSC。国外较为关注的另一种方法是依据BMSC对生长因子的反应性不同，通过选择适当的因子刺激增殖而获得含有较高比例BMSC。此外，在国外还建立了一种简单经济高效的分离BMSC的方法，即利用一种具有3mm孔径的塑料培养皿从骨髓中筛选MSC，这种方法筛选出来的BMSC均质性大于98％，并具有自我增殖和更新及分化为各种结缔组织的能力。
　　常用的细胞培养液有DMEM-F12、RPMI1640等。同时在培养基中还要加入一定比例的动物血清，一方面血清富含细胞生长、繁殖所需要的营养成分，另一方面含促进细胞贴壁的因子，使细胞能更好地贴壁生长，并且还能缓冲pH和抑制蛋白酶的作用。1995年Lennon等建立了一种无血清培养体系。由于要加入一些价格昂贵的因子，因此，这种培养方法未能得到推广。随着对BMSC研究的不断深入，今后用无血清培养基体外培养BMSC也是一种必然的趋势。
　　骨髓间充质干细胞的生物学特性
　　体外培养的BMSC体积小，结构简单，成梭形，核质比较大，能以自我繁殖的方式增殖，不表达分化相关的细胞标志，也不表达造血干细胞的表面标志。
　　BMSC最重要的特性是具有多项分化潜能，针对不同的分化方向采用不同的诱导剂，通过体外贴壁培养，可分化为多种造血以外的组织细胞，特别是来源于中胚层和神经外胚层的组织细胞。近20年来发现了多种BMSC体外诱导条件。采用地塞米松，磷酸甘油和抗坏血酸等单独或联合诱导，可以分化成为骨细胞，形成聚集体或结节，碱性磷酸酶活性增高；在高糖DMEM培养基中加入地塞米松、胰岛素、TGF-1等可诱导BMSC向成软骨细胞分化；另外，用a.巯基乙醇（BME）、二甲基亚砜（DMSO）和丁羟基茴香醚（BHA）等一些具有还原性的物质成功诱导了MSC转变为神经元，并表达神经元特有的标记，例如：神经微丝（NF.M）、神经元核心抗原（NeuN）、tau蛋白以及神经特异烯醇化酶（NSE）等；在培养液中加入1－甲基.3－异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、消炎痛时，则细胞内含脂丰富的小泡逐渐增多，即形成脂肪细胞。目前，仍未筛选到BMSC上特有的标记分子，尚无直接方法可进行鉴定。各实验室鉴定BMSC的方法都是通过在培养过程中出现分化表型，然后逆推得知是否为MSC.对细胞表面蛋白如SH-2,SH-3,SH-4,SB-10,
　　CD29，CD84,CD71,CD90,CD106,CD120a和CD124等成阳性反应，而
　　CDla,CD31,CD34,CD14,CIM5,CD56和ESA则为阴性。在筛选时阴性反应也可以作为一定的参考。据报道，BMSC的表面抗原并不特别，它具体有间质细胞、上皮细胞和内皮细胞表面抗原的特征，即它可表达多种黏附相关分子。例如：整合素亚基a4、a5、1以及整合素3、5，ICAM.1，CD44等。BMSC除了可分化形成多种基质细胞外，它本身还可分泌多种造血生长因子来支持造血。例如白介素、趋化因子等。
　　骨MSC在临床上的应用及前景
　　BMSC在体外易于分离培养，并能保持其多向分化潜能，遗传背景稳定，植入体内无免疫排斥反应，即使是同种异体移植，由于BMSC属于未分化的前体干细胞，其细胞表型的分化尚不成熟，BMSC移植后有排斥也十分微弱。BMSC可被作为细胞工程中较理想的种子细胞，并很有可能作为自体细胞构建的组织工程化骨组织应用于临床。目前，对BMSC在骨与软骨损伤方面的研究较深，美国bruder采用扩增后的人BMSC作为移植物进行骨再生研究，结果发现BMSC产生新的骨组织，可用于重建临床上明显的骨缺失，为自体骨移植开辟了新渠道。在体外将覆盖有BMSC的陶瓷支架植入狗股骨缺损处，结果发现比单纯植入陶瓷支架促进骨折愈合的效果要好。同样，将覆盖有已分化为软骨细胞的碳纤维网植入兔受损关节部位，结果也显示出比单纯植入碳纤维网更明显的促进关节软骨修复的作用。在Ⅰ期临床上，BMSC已作为在大剂量化疗后骨髓移植的辅助治疗。Koc等将自体造血干细胞与培养扩增后的BMSC共输入高剂量化疗后的晚期乳腺癌患者，可使造血功能恢复加快。将人BMSC注入大鼠纹状体内，结果发现BMSC向邻近脑组织迁移，并逐渐丢失BMSC上的标志蛋白，例如：骨胶原蛋白、纤维连接蛋白，并且表现出与神经胶质细胞一样的特征（GFAP）；将雄性大鼠的骨髓植入放射线致死量照射的同系雌性大鼠体内，通过Y染色体探针原位杂交和不同基因表型的检测发现，该大鼠肝脏有供体骨髓来源的肝脏卵原细胞，且能够分化为成熟的肝脏细胞。利用培养自体的BMSC悬浮在胶原凝胶的载体上，在兔的跟腱作1cm长的断口损伤，把细胞－凝胶复合物种植在肌腱的接缝上，同时在对侧肌腱作较小的切口，结果发现装载BMSC的种植物能够使损伤的肌腱在生化特性、结构和功能上得到修复。近来，BMSC在分子细胞生物学方面的应用吸引了越来越多的科研工作者的关注。BMSC由于独特的生物学特性使得外源基因易表达。在体外将BMSC的基因修饰后用于临床治疗，可以避免传染载体内产生的副作用。大量的实验证明，贴壁生长的BMSC经过介导容易导入外源性基因，并能在体能长期高效的表达，研究证实，使用包含猿白血病病毒外壳的逆转录病毒载体将VⅢ因子基因转入人或鼠的BMSC具有很高的传染率。目前在人和动物的BMSC中已成功转入了几种不同外源基因，且未能引起细胞性能的缺陷。同时也可以在体外跟踪含遗传标记的BMSC，将正常基因导入人发生异常突变的动物体内。例如有人将标记rhBMP的基因导入动物体内的BMSC内，将BMSC移植回动物大腿骨的骨损伤部位，在第8周观察到了骨恢复。有实验证明基因修饰后BMSC能够存活于大脑，并激活和表达基因产物。例如将胶质细胞来源的神经营养因子（GDNF）的基因转入到雄性鼠的BMSC中，然后把这些细胞静脉注入到健康雄性鼠体内，8周后建立帕金森氏症的模型，观察转入GDNF基因后的BMSC对黑质细胞的保护作用，结果发现酪氨酸酶(TH)呈阳性，黑质神经元明显高于对照组；Schwarz等用基因工程技术将TH和GTP水解酶Ⅰ的基因转入BMSC中，再将其输入到帕金森氏症的兔模型中，结果发现被转入的基因能够在体内持续表达9d；在血友病治疗方面，baroffio等将人的FIXcDNA经逆转录病毒介导转入BMSC中，然后静脉注入狗体内，第2d检测到人FIX水平达0.233ug/ml,可大大减轻B型血友病病人的症状。除此之外，经过体外大量扩增基因操作的BMSC还可治疗许多其他疾病。

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