在全球公共卫生问题中，慢性传染性疾病结核病的形势是异常严峻和迫切的，我国的结核病疫情更显严重，属全球22个结核病高负担国家之一，结核病的患病人数在全球仅次于印度居第二位。现今结核病仍然是世界卫生组织(WHO)和我国重点防治的重大传染性疾病之一。2012年发病率在各种传染病发病率中排第二位[1]。
摘要:目的：探讨基于γ-干扰素释放的T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在结核病诊断中的意义。方法：首先对2013年1月-12月间在我院住院的肺结核病人30例，结核性胸膜炎30例，结核性脑膜炎9例进行T-SPOT.TB检测，并分别对他们的血清、胸腔积液和脑脊液进行腺苷脱氨酶(ADA)检测，在某医院职工进行年底查体时，采用T-SPOT.TB对他们进行检测，对他们的血清进行ADA检测，在保密个人信息的前提下，调查所有进行T- SPOT试验的职工的健康状况。结果：肺结核病人30例，T-SPOT.TB阳性30例,ADA阳性25例，结核性胸膜炎30例，T-SPOT.TB阳性 30例，ADA阳性27例，结核性脑膜炎9例，T-SPOT.TB阳性9例，ADA阳性5例。某医院共有420名工作人员查体，做T-SPOT试验的共 291人，阳性54人，阳性率为18.6%，阴性237人，经调查及询问本人发现，54人中有3人曾先后患肺结核并治疗，现已治愈停药。其他51人皆无症状(如：午后低热，盗汗等)、无体征(如：胸部X光片无病变，包括钙化灶、无胸腔积液)、内科、外科检查无淋巴结肿大，无关节肿大、疼痛等，基本排除活动性结核病。结论：T-SPOT.TB作为结核菌感染检测的最为准确的方法之一，敏感性极高，各种结核病病人都表现阳性，而感染过结核菌未发病的人一般也都表现为实验阳性，由此可见：T-SPOT.TB阳性对结核病的诊断具有强大的支持作用，但存在一定的假阳性，而通过ADA阳性诊断结核病存在一定的假阴性，两者联合，能明显提高阳性率和特异性;但T-SPOT.TB检测阴性，基本可排除结核病(HIV病人除外)[1]，对结核病的排除具有十分重要的意义。
关键词：职称论文发表价格,T-SPOT.TB,结核病,阴性排除
TO investigate the Clinical significance of T-SPOT.TB assay in thediagnosis of Tuberculosis
Objective: To investigate the significance thatT-SPOT.TB assay based on the release of interferongamma in the diagnosis of tuberculosis.
Methods :First, Random select 30 Pulmonary tuberculosis cases,30 Tuberculous pleurisy cases and 9Tuberculous meningitis cases inpatient during 2013 Jan. to 2013 Dec. using T-SPOT.TB and ADA to detect them . When one hospital staffs check their bodies, in the case of informed consent, using T-SPOT.TB to detect them .Then survey their health status and pledge myself to a top secret. At the same time using T-SPOT.TB to detect 30 patients that been diagnosed and are receiving treatment for tuberculosis.
Results: T-SPOT.TB Positive numbers are:30 cases, 30 cases, 9 cases. ADA Positive numbers are 25 cases, 27 cases, 5 cases, There are 420 hospital staffs that check their bodies this time, andin the experiment of a total of 291 people, There are 54 people was positive, the positive rate was 18.6%, There are 237 people was negative. In fact, there are 3 people in 54 people had been suffered from tuberculosis and have now been cured. The other 51 people had no symptoms (such as: afternoon fever, night sweats), no signs (such as: no lesions after X ray chest, including calcification，no pleural effusion) , surgical, medical examination no lymph node swelling, no joint swelling or pain, Say in another way, the 51 people are ruled out active tuberculosis. At the same time using T-SPOT.TB to detect 30 patients that were suffered from tuberculosis and are receiving treatment, all the 30 cases were positive.
Conclusion: T-SPOT.TB is one of the most accurate methods for detecting latent TB infection, it is high sensitivity. People infected with TB are usually manifested positive, Whether or not he has TB disease at that time. T-SPOT.TB test is negative have very important meanings for eliminating TB: T-SPOT.TB test was negative can exclude tuberculosis
Key words:T-SPOT.TB，tuberculosis， negative test can exclude the disease
痰涂片和或/培养阳性是结核病诊断的金标准，但涂片法敏感性低，约30%阳性率，培养法阳性率稍高，但时间长，需3-8周，不利于早期发现结核病及控制传染源。我们本着早发现，早治疗的原则，想寻找一种能做出快速诊断的方法，采用结核分枝杆菌感染T细胞斑点实验(T-SPOT.TB)，根据斑点形成数量检测各种结核病的病人及医院全体职工(有部分职工因时间关系未做此项检测)外周血特异性T细胞，以探讨该技术在结核病诊断中的应用价值及意义。
1.资料和方法
1.1 研究对象一组为随机选取2013年1月-12月间在我院住院的肺结核病人30例，结核性胸膜炎30例，结核性脑膜炎9例，先进行T-SPOT.TB检测和血清、胸腔积液及脑脊液的ADA检测;第二组为某医院在职并进行健康查体职工，包括各临床科室的医生、护士，各医技科室工作人员，行政及后勤科室的工作人员，男100人，女191人，共291人。
1.2 方法
1.2.1样本采集69例在院病人，由医生先与病人沟通，在病人同意后由护士在病人做其他血液检验时多抽一管肝素锂抗凝血5ml，颠倒混匀，备用。结核性胸膜炎30例，在为病人抽取胸腔积液进行检验时多留一管进行ADA检测，结核性脑膜炎9例，在为病人抽取脑脊液进行检验时多留一管进行ADA检测;在某医院工作人员查体时，采集生化血液之后，采集静脉血5ml于含有肝素锂抗凝剂的试管中，立即颠倒混匀5-8次，备用。
1.2.2酶联免疫斑点试验按照T-SPOT.TB(英国Oxford Immunotec Ltd生产，上海信长有限公司代理)试剂盒的说明书进行操作，采用密度梯度法离心提取单个核细胞(PBMC)，并计数单个核细胞浓度，用细胞培养液调节细胞浓度至2.5*109/L，在已包被抗IFN.7抗体微量板的4个孔中，分别加入细胞培养液作为阴性对照，植物血球凝集素(PHA)作为阳性对照,结核杆菌特异混合多肽A和B分别含EsAT.6和CFP.10(Oxford Immunotec Ltd,Oxford UK)。然后在每个孔中加入100?l上述细胞悬液，轻轻混匀。把微量板放在37℃培养16-20小时后，用PBS洗板4次，加入碱性磷酸酶标记的小鼠抗人IFN.7单克隆抗体，轻轻混匀，在2-8℃下孵育1小时。取出用PBS洗涤4次。最后每孔加入显色底物液BCIP/NBTPLUS,室温静置7分钟后观察结果，并在放大镜(或显微镜)下进行斑点计数。
1.2.3结果判断根据试剂盒使用说明判断结果：如果阴性对照孔SFC为0-5，则测试孔SFC-阴性对照孔SFC≥6视为阳性，如果阴性对照孔SFC≥6,则测试孔SFC≥2倍阴性对照孔SFC视为阳性。
1.2.4ADA 的检测是用美国贝克曼公司生产的仪器DXC800和原装进口试剂进行测定，以血清ADA>25,胸腔积液ADA>40，脑脊液ADA>10为阳性。
1.3统计学方法采用X2检验计算组间差异，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1第一组在院病人组全血T-SPOT.TB测定结果及对应标本ADA结果比较见表1：
T-SPOT.TB法和ADA法比较，肺结核组 X2=5.45，P<0.05，结核性胸膜炎组X2=3.15，P>0.05,结核性脑膜炎组X2=5.1，P<0.05。由此可见，对于肺结核和脑膜炎的诊断，T-SPOT.TB法的阳性符合率要明显高于ADA法，差别有统计学意义;而对于结核性胸膜炎的诊断，T-SPOT.TB法和胸腔积液的ADA法比较，差异无统计学意义。把各组综合起来，都看做结核病，T-SPOT.TB法和ADA法比较X2=10.78，P<0.05，差别有统计学意义。
查体组各科室全血T-SPOT.TB测定结果见表2：
呼吸科病房与其他病房科室比较，X2=1.66，P>0.05，差异无统计学意义;呼吸科病房与医技科室比较，X2=0.76，P> 0.05，差异无统计学意义;呼吸科与后勤科室比较，X2=5.29，P <0.05，差异有统计学意义;其他病房科室与医技科室比较，X2=0.21，P>0.05，差异无统计学意义;其他病房科室与后勤科室比较，X2=2.10，P>0.05，差异无统计学意义;医技科室与后勤科室比较，X2=2.15，P>0.05，差异无统计学意义。查体的 291人中有54例阳性，阳性率为18.6%，与王森、路丽苹报告的结核病人密切接触者的阳性率19.1%、22.22%相近[2][3]，阴性237 人。经调查及询问本人发现，54人中有3人曾先后患肺结核并治疗，现已治愈停药，3人分别分布于呼吸科、其他病房科室、后勤科室,分布无集中现象。其他 51人皆无症状(如：咳嗽、午后低热，盗汗等)、无体征(如：胸部X光片无病变，包括钙化灶、无胸腔积液)、内科、外科检查无淋巴结肿大，无关节肿大、疼痛等，基本排除活动性结核病;T-SPOT.TB检测阴性的237人，经调查体检结果，皆无患结核病。
查体组T-SPOT.TB阳性人员进行同期血清ADA检测结果见表3：
X2=108，P <0.05，差异有统计学意义。
3 结论
我们利用循证医学的方法，对各组人群进行了T-SPOT.TB和ADA的检测，只有结核性胸膜炎组的全血T-SPOT.TB检测和胸腔积液的ADA检测阳性符合率差别无统计学意义，其他情况T-SPOT.TB检测的阳性符合率都高于ADA检测，差别有统计学意义。T-SPOT.TB作为结核菌感染检测的最为准确的方法之一，敏感性极高[4]，凡是患病者试验结果皆为阳性:72/72，包括治愈的和现病人，阳性率为100%，感染过结核菌而现今未发病的人检测结果也呈阳性，虽然他现在未发病，本研究51例。因此单纯T-SPOT.TB检测阳性作为“结核病”的诊断有一定的假阳性，单纯ADA检测阳性作为 “结核病”的诊断有一定的假阴性，临床医生应两者结合或结合其它检查来确诊结核病;但T-SPOT.TB检测阴性对结核病的排除具有十分重要的意义。
医院中的工作人员，比起社区中普通居民而言，有更多的机会接触到肺结核病人，即有更高的几率感染结核菌，特别是呼吸科的工作人员[5]。其患病率(3/291)比社区中居民的患病率(459/10万)也高[1]。因此，在日常的工作中，进行标准预防的基础上，还应加强呼吸道防护，扎实搞好医院感染管理。
4 讨论
呼吸道疾病的种类本来就多，种种原因引起的雾霾天气天数增加等因素引起了更多呼吸道疾病的发病，众多的呼吸道疾病在临床的诊治过程中往往都要与肺结核进行鉴别诊断，由于卡介苗的普遍接种，病人的症状及X线等影像学表现有时不那么典型，病原体诊断的阳性率低，阳性率稍高些的实验又费时，因此，建立更加快速、准确的诊断方法对于早期发现和及早治疗结核病至关重要。近年，T-SPOT.TB检测等方法相继应用于临床，其敏感性大大提高。本组研究资料证实，结核病人的T-SPOT.TB检测结果100%呈阳性反应，但T-SPOT.TB检测结果阳性的并不全部是病人，有相当一部分是感染过结核菌而并未发病的健康人和已经治愈的健康人，因此，T-SPOT.TB检测结果阳性支持结核病但不能诊断结核病，要结合其他的检查来综合诊断，结合ADA的检测即是一个不错的选择;但T-SPOT.TB检测结果阴性对于排除活动性肺结核具有十分良好的敏感性和特异性，可以广泛应用于呼吸道疾病的鉴别诊断中[6][7]。
在我院的生殖科(特别是不孕不育科)及骨关节病科，自身免疫性疾病科等科室已广泛利用T- SPOT.TB试验来代替结核菌素试验，作为结核病的排除试验，结束了往日结核菌素实验因受卡介苗接种的影响而结果临界值很难判断的情况，收到了良好的效果。基于SFC的T-SPOT.TB试验结果清晰，易于判断，大大提高了结核病诊断的阳性率，其检测结果阴性对结核病的排除具有快速，稳定等特点，且具有良好的敏感性和特异性，对于肺外结核病与其他疾病的鉴别诊断具有十分重要的意义。
T-SPOT.TB检测亦存在一些缺点以及亟待解决的问题，如检测步骤复杂、对操作人员的技术及实验室条件要求相当高、仪器及试剂的价格高昂等，这使得T-SPOT.TB检测仅在一些发达国家及医疗、生活水平相对较高的国家及地区开展，许多低收入的结核病流行国家却无法普及。本研究的不足是病人数量有限，样本量较小，一定程度影响了结果的精确性。
参考文献:
1. 人类免疫缺陷病毒感染者CD4+T淋巴细胞计数与结核分枝杆菌共感染的相关性，中华传染病杂志2012年第6期，张馨�，蒋为民等
2. 《全国第五次结核病流行病学现场调查》，卫生部疾病预防控制局，2011年3月23日，郝阳。
3. 血清学诊断方法及T细胞斑点试验在结核病诊断中的应用，中华临床感染病杂志2013年2月第6卷第1期，13-17页，王森，陈嘉臻等。
4. 以T- SPOT.TB 检测为依据的结核病人密接者感染状况及影响因素研究。现代预防医学2013 年第40 卷第3 期，568-570页，路丽苹， 洪建军， 金晓萍， 沈红英。
