艾纳香(Blumea balsamifera)是菊科艾纳香属多年生灌木样草本植物，在我国主要分布在贵州、云南、广西三地，过去常作为民间用药，可以温中活血，祛风除湿，也可以杀虫，主要用于治疗寒湿泻痢、腹痛肠鸣、跌打损伤等，以滇桂艾纳香为原料生产的“妇血康颗粒”在治疗妇女功能性子宫出血和产后出血方面有独特的疗效 [1]。
摘要：运用乙醇初提后用微波辅助提取的方法从菊科艾纳香属植物艾纳香(Blumea balsamifera)中提取生物碱，结合单因素试验和正交试验探索最佳提取条件，最终得出提取艾纳香中生物碱的最佳条件是，以80%的乙醇为提取剂，料液比为1∶40(m/V，g∶mL)，在微波-紫外-超声波三位一体合成萃取反应仪中提取25 min。运用酸性染料比色法测定其总生物碱含量，结果表现为，艾纳香中茎部的生物碱含量最高，为7.77 μg/g;其次是根部，为3.66 μg/g;叶部最少，为2.34 μg/g。
关键词：农业科技论文投稿,艾纳香(Blumea balsamifera),生物碱,提取条件,含量测定
Extraction and Determination of Total Alkaloids in Guizhou Blumea balsamifera
YAN Min，WANG Yu-feng，TANG Hong-min
(The Chemistry and Environment Department， Guizhou Minzu University，Guiyang 550005，China)
Abstract： Alkaloids were extracted from Blumea balsamifera with ethanol extraction and microwave-assisted extraction method. The extraction conditions were optimized. The optimal conditions were using 80% ethanol extraction agents with material liquid ratio of 1∶40 and extracting 25 minutes in microwave-ultrasonic digestion machine. The content of total alkaloids was determined with acid dyes colorimetric method. The disposition of alkaloids in B. balsamifera was the highest in the stem(7.77 μg/g)， the second in the root (3.66 μg/g)，and the least in the leaf (2.34 μg/g).
Key words： Blumea balsamifera; alkaloid; extraction conditions;content determine
艾纳香作为天然中草药，含有多种有效成分，已经测定的如黄酮类、有机酸、萜类等[2-4]。生物碱作为天然中草药的重要有效成分，具有很高的研究价值，常见于很多植物中，在菊科植物中也有大量分布，但是目前并没有文献明确表明艾纳香中含有生物碱，因此有必要对其进行研究来弥补这一空缺。研究结合各类生物碱的提取及分析方法，拟定以乙醇初提后用微波辅助提取的方法来提取艾纳香中的生物碱[5-9]，并采用酸性染料比色法测定其含量，探索最佳提取条件和艾纳香中生物碱的分布情况。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1供试材料艾纳香全草采自贵州省罗甸县，由贵州大学林学院熊中华副教授鉴定。
1.1.2仪器与试剂756PC紫外可见分光光度计购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司，微波-紫外-超声波三位一体合成萃取反应仪购自上海新仪微波化学科技有限公司，旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂，盐酸小檗碱标准品(纯度≥98%)购自昆明绿盟科技有限公司。
1.2方法
1.2.1样品溶液的制备及生物碱的检测将艾纳香全草烘干粉碎后，称取2.5 g艾纳香粉末两份分别置于两个250 mL的锥形瓶中，均加入体积分数为70%的乙醇溶液50 mL，在30 ℃下用微波-紫外-超声波三位一体合成萃取反应仪提取10 min。一份过滤得粗提取液，置于烧杯中备用;另一份提取液过滤后，用旋转蒸发仪浓缩回收乙醇，浓缩液转移至分液漏斗中，滴加2 mol/L盐酸调至pH 3～4，用等量氯仿萃取2～3次，去除色素和酸不溶性杂质，得到的酸水层再以100 g/L氢氧化钠调至pH 10～11，同样以等量氯仿萃取2～3次，合并氯仿层，定容至10 mL，作为提纯后的样液。取粗提取液进行生物碱的沉淀试验。用毛细管吸取粗提取液点样在硅胶板上，重复点样10次，待样点干后，将硅胶板浸入碘化铋钾溶液中，迅速拿出后用清水轻轻冲洗掉表面多余的溶液，观察样点处的颜色。另采取同样的操作，分别将硅胶板浸入到碘化钾碘、磷钼酸溶液中，观察样点处的颜色。
1.2.2pH对染色效果的影响分别精确吸取提纯后的样液1 mL置于7支分液漏斗中，分别加入之前配制好的不同pH的溴甲酚绿缓冲液2 mL，再依次加入氯仿10 mL，充分振荡使其反应完全，静置分层后，取下层氯仿层。首先在紫外可见分光光度计下对其进行波长扫描，对扫描结果综合分析后得出，艾纳香生物碱样液在 413～419 nm波长范围内有最大吸收，结合资料可知，溴甲酚绿与生物碱染色在415 nm处有最大吸收[10]，因此本试验以415 nm为最大吸收波长，并应用于之后的吸光度测定中。 1.2.3最佳提取条件的确定
1)单因素试验。运用乙醇初提后用微波辅助提取的方法提取艾纳香中的生物碱，结合资料信息，选取3个可能影响提取效果的因素乙醇体积分数、料液比(m/V，g∶mL，下同)、提取时间进行研究 [11]。①乙醇体积分数对提取效果的影响。平行称取5份1.000 0 g左右的艾纳香粉末，分别加入乙醇体积分数为60%、70%、80%、90%、95%的提取液50 mL，在30 ℃下用微波-紫外-超声波三位一体合成萃取反应仪提取10 min。按照“1.2.1”中的操作方法对提取液进行提纯，用氯仿定容至10 mL，加入2 mL溴甲酚绿缓冲液，充分振荡使其反应，转入分液漏斗中，静置分层后取下层氯仿层，测定其吸光度。②料液比对提取效果的影响。平行称取5份1.000 0g左右的艾纳香粉末，分别加入乙醇体积分数为90%的提取液20、30、40、50、60 mL(料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)，30 ℃下在微波-紫外-超声波三位一体合成萃取反应仪中提取10 min。之后的操作同上，取下层氯仿层，测定其吸光度。③提取时间对提取效果的影响。平行称取5份1.000 0 g左右的艾纳香粉末，均加入乙醇体积分数为90%的提取液50 mL，在30 ℃下用微波-紫外-超声波三位一体合成萃取反应仪分别提取5、10、15、20、25 min。之后的操作同上，取下层氯仿层，测定其吸光度。
2)正交试验。按照之前选定的3个因素的合理水平设计正交试验。正交试验因素与水平见表1。
1.2.4生物碱含量的测定
1)标准溶液的配制和标准曲线的绘制。研究表明，盐酸小檗碱在酸性条件下经溴甲酚绿染色后的氯仿萃取层在410 nm处有最大吸收[12]，与本试验中样液的最大吸收波长很接近，且相对较易购得，因此本试验采用盐酸小檗碱作为标准品。首先配制标准溶液并绘制标准曲线，以标准品浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2)艾纳香不同部位的生物碱提取及含量测定。分别称取根、茎、叶部位的艾纳香 1.000 0 g左右，加入体积分数为80%的乙醇溶液40 mL，在微波-紫外-超声波三位一体合成萃取反应仪中提取20 min，之后按照“1.2.1”中的操作提纯，然后用氯仿定容至10 mL，加入2 mL溴甲酚绿缓冲溶液，充分振荡分层后，取下层氯仿层测定吸光度，每个部位平行测定3次。生物碱含量=提取出的生物碱质量(μg)/艾纳香原料质量(g)。
3)稳定性试验。另称取1 g左右的艾纳香，在最佳提取条件下提取，然后采取同上的操作方法，在1 h内进行扫描，每间隔10 min扫描一次，统计结果。
2结果与分析
2.1样液生物碱的检测结果
将硅胶板浸入碘化铋钾溶液中进行处理，观察到样点处被染上了橘红色，证明提取液中可能含有生物碱。另采取同样的操作，分别将硅胶板浸入到碘化钾碘、磷钼酸溶液中，观察到样点分别被染上了淡黄色和红褐色，证明提取液中含有生物碱。
2.2pH对染色效果的影响
在415 nm处测定各不同pH样液的吸光度，结果见图1。由图1可知，随着pH的增大，吸光度逐渐降低，因此最适宜的pH为4.23，所以以下测定过程中均采用pH 4.23的溴甲酚绿缓冲液进行染色。
2.3最佳提取条件的确定
2.3.1单因素试验
1)乙醇体积分数对提取效果的影响。由图2可知，随着乙醇体积分数的增大，吸光度先逐渐增大，随后开始减小。在乙醇体积分数为90%时吸光度有最大值，取70%、80%、90%为该因素的3个合理水平。
2)料液比对提取效果的影响。由图3可知，随着乙醇用量的增大，吸光度先逐渐增大，随后开始减小。在料液比为1∶50时有最大吸光度，取1∶30、 1∶40、1∶50为该因素的3个合理水平。
3)提取时间对提取效果的影响。由图4可知，随着提取时间的增大，吸光度逐渐增大，随后趋于稳定。在提取25 min时有最大吸光度，取15、20、25 min为该因素的3个合理水平。
2.3.2正交试验结果由表2可知，本试验最佳的水平组合是A2B2C3，即提取的最佳条件是用80%的乙醇，以1∶40的料液比提取25 min。
2.4生物碱含量的测定结果
2.4.1标准曲线方程标准曲线见图5，标准曲线方程为A=0.166 1C+0.006 8，r=0.997 5。
2.4.2艾纳香不同部位的生物碱含量试验结果见表3。表3中试验号1、2、3为根部提取物，4、5、6为茎部提取物，7、8、9为叶部提取物。平行试验结果取平均值，得到根部生物碱平均含量为3.66 μg/g，茎部生物碱平均含量为7.77 μg/g，叶部生物碱平均含量为2.34 μg/g。由此可得，艾纳香中茎部生物碱含量最高，其次是根部，叶部最少。
对根茎叶3个不同部位生物碱含量均平行测定了3次，以测定的生物碱含量来考察其重复性，计算得根部平行试验的RSD=5.74%，茎部RSD=5.34%，叶部RSD=9.00%，3组试验均重复性良好，因此本试验方法重复性良好。
2.4.3稳定性试验稳定性试验结果见图6，计算得RSD=0.55%，说明该试验方法稳定性良好。
3结论与讨论
试验用改良的碘化铋钾试剂、碘化钾碘试剂和磷钼酸试剂进行生物碱沉淀试验，证明艾纳香中含有生物碱，这一结果填补了艾纳香中生物碱研究的空白，具有重要意义。
在参考了其他药用植物中生物碱的提取方法后，拟定了用乙醇初提后用微波辅助提取的方法来提取艾纳香中的生物碱。参考资料设计单因素试验和正交试验，探索最佳的提取条件。结果得出，该方法下的最佳提取条件是：用体积分数为80%的乙醇溶液，以1∶40的料液比提取25 min。在最佳提取条件下分别对植株的根茎叶不同部位进行提取，测定吸光度，计算生物碱含量，结果得出：艾纳香中茎部生物碱含量最高，平均值为7.77 μg/g;根部次之，平均值为3.66 μg/g;叶部最少，平均值为2.34 μg/g。
参考文献：
[1] 黄泰康，丁志遵，赵守训，等. 现代本草纲目[M]. 北京：中国医药科学技术出版社，2001.
[2] 周欣，杨小生，赵超. 艾纳香挥发油化学成分的气相色谱-质谱分析[J]. 分析测试学报，2001，20(5)：76-78.
[3] 郝小燕，余珍，丁智慧. 黔产艾纳香挥发油化学成分研究[J]. 贵阳医学院学报，2000，25(2)：121-122.
[4] 王治平，孟祥平，樊华，等. 滇桂艾纳香挥发油化学成分的GC-MS分析[J]. 中草药，2005，36(8)：1138-1139.
[5] 黎萍，杨敏丽. 披针叶黄华中金雀花碱类生物碱的提取工艺[J]. 华西药学杂志，2007，22(1)：7-8.
[6] 高淑云，焦灿. 麻叶千里光中生物碱的提取及测定分析[J]. 食品科学，2009，30(18)：261-266.
[7] 杨蓉，梁冰，李延芳，等. 紫背天葵中总生物碱含量测定方法的研究[J]. 四川化工，2007，10(3)：31-34.
[8] 肖凤艳，高静，孙莉佳. 紫金龙总生物碱超声波辅助提取工艺[J]. 湖北农业科学，2011，50(20)：4256-4257.
[9] 张红梅，程雪梅，王长虹，等. 黄连中生物碱提取工艺的正交试验研究[J]. 中国医药工业杂志，2008，39(8)：588-590.
