对葡萄酒中柠檬酸检测方法的研究

　　摘要：葡萄酒中柠檬酸的检测方法有很多，其中应用比较多的有：高效液相色谱法、毛细管电泳法、酶法、微电子溶出法、化学法等等。本文主要就褪色分光光度法对葡萄酒中柠檬酸的含量的测定方法进行详细介绍，以供读者参考。
　　关键词：葡萄酒；柠檬酸；褪色分光光度法
　　一、褪色分光光度法测定柠檬酸含量的原理
　　褪色分光光度法测定柠檬酸含量的原理是：使用Fe（III）—磺基水杨酸作为指示剂，当Fe（III）—磺基水杨酸处于pH为4.2—4.6的酸性溶液中时会生成紫红色的络合物，当向溶液中加入柠檬酸标准液或是含有一定量的柠檬酸溶液时，生成的紫红色络合物会褪色至橙黄色。然后在470nm处进行吸光度的测定，吸光度的减小的值与柠檬酸的含量在一定的范围内是成正比的，根据这种方法可以将试样中的柠檬酸进行定量分析。
　　二、实验所用的仪器
　　1754型紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司
　　2DT-100单盘天平北京光学仪器厂
　　3PHS-3C精密酸度计成都方舟科技开发公司
　　三、仪器条件的选择
　　本次实验的仪器选择方面主要在于对分光光度计和PHS-3C精密酸度计的选择上，由于实验的方法需要进行吸光度的测定，因此需要使用灵敏性高的紫外可见分光光度计进行测定。PHS-3C精密酸度计可以准确的将溶液的pH测定出来，本实验需要将反应的pH进行精确测定，因此需要使用。DT-100单盘天平的使用主要是在试剂的配置时需要。
　　四、实验所需试剂
　　所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。
　　1Fe3+溶液(1.000×10-2mol•L-1)：称4.8220gNH4Fe(SO4)2•12H2O，用0.025mol•L-1HCLO4溶解，加水定容至1000mL。
　　2磺基水杨酸溶液(1.000×10-2mol•L-1)：称磺基水杨酸2.5420g，用0.025mol•L-1HCLO4溶解，加水定容至1000mL。
　　3HAc-NH4Ac溶液：取冰HAc28mL，加500mL水稀释，然后用浓氨水调溶液pH至4.5为止。HCLO4溶液(1.0×10-2mol•L-1)。
　　4葡萄酒试样：取1mL葡萄酒液定容于100mL的容量瓶中进行稀释100倍。
　　五、褪色分光光度法的测定方法
　　1在25mL的比色管中分别加入刚配置好的新鲜的Fe（III）溶液1.0mL、磺基水杨酸溶液4.0mL和HAc-NH4Ac缓冲液4.0mL，水定容至刻度，边定容边轻轻摇匀。
　　2放置10min后，使用1.0cm的比色皿，以蒸馏水作为对照，在470nm处进行吸光度的测定，得到磺基水杨酸铁络合物的吸光度A1。
　　3取另一只25mL的比色管，与上述操作相同，不过注意在定容前先加入0.5mL稀释了的葡萄酒试样，然后进行470nm处的吸光值的测定，测得的吸光值为A2，即为褪了色的磺基水杨酸铁络合物。
　　4进行计算，根据ΔA=A1-A2进行计算。
　　5柠檬酸标准曲线的绘制。按上面的方法，仅在加入试样时改为加入柠檬酸标准液，依次为0.0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL。分别测其吸光值，并求出与之相对应的褪色吸光值差ΔA的值，然后输入Excel中进行柠檬酸溶液标准曲线的绘制，并求出相应的回归方程，得到的方程为：
　　ΔA=0.6294a+0.0396，其中a是柠檬酸的含量，单位为mg/25mL。其适用范围为0—40μg/mL。相关系数是0.9923，大于所要求的临界值标准0.917，说明了此回归方程有效。回归方程制作成表格，如下表：
　　
　　6然后根据上一步得到的葡萄酒试样的ΔA值进行代入回归方程：ΔA=0.6294a+0.0396中，求出a，即为葡萄酒试样中的柠檬酸含量。
　　六、实验过程中应考虑的问题
　　1测定波长的选择
　　为了选择最佳的测定波长，试验在前期做了一系列的预实验，其中很重要的一个方面是测定波长的选择。由于紫外可见光分光光度计十分灵敏，测定波长稍一改变就会对整个实验的结果产生巨大的影响，因此在进行实验前一定要确定最佳的测定波长，即所谓的最大吸收波长。
　　预实验的方法是：与上面的实验原理和方法大致相同，只是在进行紫外可见光分光光度计进行测定时，测定波长分别选择：440nm，450nm，460nm，470nm，480nm，490nm，500nm，510nm。在这几个波长下进行磺基水杨酸铁的络合物以及显色剂的吸收关谱，得到的结果如下表。
　　
　　表中可以看出，当测定波长为470nm时，所得的络合物、显色剂以及ΔA的吸光值都是最大的，因此本实验就采用470nm作为柠檬酸含量测定的测定波长。
　　2显色的pH的范围
　　显色的pH的选择也很关键，因为所选的指示剂Fe（III）—磺基水杨酸只有在一定范围的酸性溶液中才能生成相应的络合物才能进行一下步骤的操作，因此实验前确定实验溶液所需的pH值的范围很有必要。
　　pH值的范围确定也是通过一系列的实验进行确定的。实验方法同上，只是将溶液的pH进行改变，分别取pH为：3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8，然后进行实验，结果显示：当pH在4.2—4.6时，所得的络合物颜色鲜艳，而且所测得的ΔA值较大并且稳定，因此，在测定时应选择的pH值范围是：4.2—4.6。其中，当pH值为4.5时，所测的ΔA值最大且最稳定，因此本实验选择pH为4.5来进行测定。
　　3试剂的用量
　　3.1磺基水杨酸和Fe离子的用量选择
　　磺基水杨酸和Fe离子作为整个实验的指示剂，其用量多少的选择是非常关键的，因此也需要通过预实验进行确定。方法依旧同上，只是将磺基水杨酸的用量进行改变，磺基水杨酸的量分别选取：3.0mL，3.5mL，4.0mL，4.5mL，5.0mL。实验结果显示，当选取磺基水杨酸的量为4.0mL时，实验所得的ΔA值最大而且最为稳定，因此本次实验所选取的磺基水杨酸的量即为4.0mL。磺基水杨酸的量一旦确定，根据络合物的化学反应可知所需的铁离子的量也是4.0mL。
　　3.2缓冲剂的用量的选择
　　缓冲溶液也是实验成败、结果准确与否的一个重要因素，缓冲溶液加的太多会稀释指示剂和试样的量，造成结果过小或是柠檬酸含量过低而不能够被检测到，ΔA值很小；但是缓冲液加的太少会使整个系统的pH值变化剧烈，使得络合物的性质等都不稳定，测得的结果自然更加不准确。

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