摘要 为了研究多壁碳纳米管(MWcnTs)联合纳秒脉冲电场(nsPEF)影响离体细胞活性的剂量效应，采用 CCK-8 检测法对比分析皮肤癌 A375 细胞活性随场强 E、脉宽 τ、脉冲个数 N 等单因素的变化规律。研究表明，细胞活性随场强和脉宽的变化具有阈值效应(S 型变化)，而随脉冲个数的变化无明显的阈值效应(指数型变化)。细胞活性随脉冲注入能量 E(τN) 0.5 的增加呈现 S 型下降。基于 logistic 模型利用一元非线性回归分析方法分别拟合得到细胞活性与三个脉冲参数间的函数关系。同时，建立细胞活性与多因素之间的归一化关系。结果表明，MWCNTs 的加入不影响细胞活性与脉冲参数间的变化规律，但是明显降低了 nsPEF 杀伤肿瘤细胞所需要的幅值，从而可以有效提高 nsPEF 在肿瘤治疗中的电气安全性。
关键词：多壁碳纳米管 纳秒脉冲电场 细胞活性 logistic 模型 归一化关系
0 引言
纳秒脉冲电场(nanosecond pulsed electric field， nsPEF)不需要毒性化疗药物的参与就能通过诱导凋亡而使肿瘤组织缩小甚至消失，避免了炎症、溃疡与药物的副作用[1,2]，对于肿瘤治疗具有特别重要的意义。然而，nsPEF 必须采用高场强，在实验过程中需要借助电极将幅值非常高的脉冲电场引入到肿瘤组织，而过高的场强容易引起靶向组织的沿面放电[3,4]，这也会对治疗过程的顺利进行、治疗设备的可靠性产生影响。近年来，碳纳米管(carbon nanotubes，CNTs)优异的电学特性在生物电效应中的应用潜力逐渐引起人们的关注。CNTs 是一种具有特殊结构(径向尺寸为纳米级，轴向尺寸为微米级)的一维量子材料，并且由于碳纳米管的结构与石墨的片层结构相同，所以具有高电导率[5]。具备大长径比以及优良电导率的 CNTs 可以增强局部场强[6]，国外一些学者已经将 CNTs 的这一特性应用到脉冲电场治疗肿瘤的领域中。根据卷曲层数的差异，CNTs 可以分为单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotubes， SWCNTs)和多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)[7]。由于 MWCNTs 的毒性低于 SWCNTs[8]，所以 MWCNTs 在生物电磁中的应用更为广泛。 Stacey 等将 MWCNTs 引入到 nsPEF(50 kV/cm， 300 ns，8 个脉冲)杀伤胰腺癌细胞系 PANC1 的实验 中 ， 利 用 台 盼 蓝 检 测 细 胞 存 活 率 [9]。 与 不 加 MWCNTs 的实验相比，MWCNTs 的引入可以使细胞存活率降低 2.3 倍，证明 MWCNTs 独特的电子特性与脉冲电场在杀伤肿瘤细胞中的协同作用。Raffa 等在脉冲电场(45-55 V/cm，40 ms，1 Hz，500 个脉冲)处理 HN9 及 CRFK 细胞的过程中将 MWCNTs (5-10 μg/ml)加入到细胞悬浮液，以此促进细胞的透化率，从而增强细胞对药物大分子的摄取，利用台盼蓝染料代替药物大分子检测细胞的通透性[10]。实验证明 MWCNTs 的引入可以将细胞通透性由 4% 提高到 80%，并在该实验的基础上提出 MWCNTs 在脉冲电场作用下的介电响应可能是导致电穿孔增强的原因。Wang 等在 MWCNTs 的存在下将脉冲电场(50 V/cm，40 ms，5 Hz，500 个脉冲)作用于乳腺癌细胞[11]。利用台盼蓝检测到细胞膜即时透化率增加至 38.62%，是不含 MWCNTs 实验的 2.77 倍。此外，还观察到细胞发生了不可逆电穿孔，在脉冲处理后 24 小时仅有 39.23%的细胞存活，而不存在 MWCNTs 的细胞存活率为 87.01%。Liu 等利用有限元法基于介电电泳理论仿真研究了单根 MWCNTs 与细胞膜在脉冲电场处理下的作用过程[12]。结果表明，MWCNTs 尖端在电场中引起的介电泳力能够实现细胞膜快速的机械变形，从而增强细胞电穿孔效应。以上研究都从不同角度证明了 MWCNTs 增强脉冲电场杀伤肿瘤细胞效果的可行性。但是，迄今为止，MWCNTs 增强脉冲电场杀伤癌细胞效果的相关研究也只是在单一脉冲因素、特定参数范围的基础上验证 MWCNTs 的引入具有增强脉冲电场生物电效应的作用，没有更加系统、全面地建立 MWCNTs 联合 nsPEF 杀伤肿瘤细胞的剂量效应。为了对后续开展机理研究选择脉冲参数提供必要的参考依据，首先必须从宏观角度研究引入 MWCNTs 后不同脉冲参数下的 nsPEF 对离体细胞的杀伤效果。对此，本文将在探究 MWCNTs 毒性的基础上系统地研究有无 MWCNTs 时细胞活性随场强、脉宽、脉冲个数等单因素的定性变化规律和定量函数关系，并建立细胞活性与多因素的归一化关系,以期为后续在肿瘤组织中的进一步研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 细胞培养将人皮肤癌
A375 细胞系(由第三军医大学基础医学研究院捐赠)置于高糖 DMEM 培养基(血清和抗生素的占比分别为 10%和 1%)中，于 CO2 体积分数为 5%、温度为 37℃、饱和湿度的环境中生长，1-2 天传代一次。
1.2 MWCNTs 毒性的确定
MWCNTs 分散液(W/V=20 000 μg/ml)购置于中科院成都有机化学有限公司，所用 MWCNTs 的外径和长度分别为 8-15 nm 和 50 μm 左右，其在透射电子显微镜(transmission electron microscope， TEM)下的微观结构如图 1 所示。取不同体积 MWCNTs 分 散 液 于 新 鲜 培 养 基 中 ， 分 别 调 整 MWCNTs 的最终浓度为 0 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml、400 μg/ml。将处于对数生长期的 A375 细胞用 0.25%的胰酶消化后离心 5 分钟(800 转/分钟)，弃去上清液，用上述含有不同浓度 MWCNTs 的培养基制成细胞悬液，调整细胞浓度为 1×106 cells/ml。将上述细胞悬液于室温下静置 1 小时后用 PBS 离心清洗两遍，并用不含 MWCNTs 的新鲜培养基重悬(细胞浓度为 1×105 cells/ml)，取 200 μl 溶液于 96 孔板中，在 CO2 体积分数为 5%、温度为 37℃、饱和湿度的环境中继续培养 8 小时。利用 CCK-8 试剂盒检测各个实验组的细胞活性，对照组为 MWCNTs 浓度为 0 μg/ml 的细胞悬液。
1.3 细胞活性的检测使用
CCK-8 细胞增殖实验评估细胞活力，当含有细胞的 96 孔板在孵箱中培育 8 小时后，利用移液器缓慢吸掉 96 孔板上清液，用 PBS 清洗两遍并重新加入 110 μl 培养基与 CCK-8 的混合溶液(培养基与 CCK-8 的比例为 10:1)，继续于孵箱中培养 1.5 小时。在该测定中，CCK-8 可以被细胞线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物 Formazan。利用酶标仪(EPOCH2，Biotek)测量每组实验的吸光度，波长设定为 450 nm。细胞活性=(实验组吸光值-空白组吸光值)/ (对照组吸光值-空白组吸光值)×100%，其中空白组为不含细胞的混合培养液。
1.4 nsPEF 系统
实验平台如图 2 所示，相关装置包括：实验室自制的纳秒脉冲发生器[13]、现场可编程逻辑门阵列( Field-Programmable Gate Array ， FPGA) 模 块(AX301，Alinx)、个人电脑(PC)、示波器(WavePro 7 Zi–A，Teledyne Lecroy)、高压探头(PPE5KV， Teledyne Lecroy)、 皮 尔 森 线 圈 ( 2877， Pearson Electronics)、电击杯(BTX，容积 450 μl，间距 2 mm)。在 PC 端对 FPGA 模块编程，通过控制 FPGA 产生特定脉宽及频率的信号以控制纳秒脉冲发生器的输出，发生器的输出直接连接到装有细胞悬浮液的电击杯两端，同时利用示波器对细胞悬液两端的电压以及流经悬液的电流信号进行采集。幅值为 1 kV，脉宽为 300 ns 时，脉冲电压和电流波形如图 3 所示。
1.5 nsPEF 处理细胞的实验方案
表 1 为实验所采用的脉冲参数水平值，固定脉冲频率为 1 Hz，MWCNTs 浓度为安全剂量下的最大值，其余参数(场强 E、脉宽 τ、脉冲个数 N)均为 5 水平。当探究细胞活性随某一脉冲参数的影响规律时，其余参数均设定为中间值，例如研究场强对细胞活性的影响规律，脉宽和脉冲个数分别设定为 300 ns 和 100。对于每一组实验方案，分别在加 MWCNTs 以及不加 MWCNTs 的情况下实施。为了使大部分细胞在 nsPEF 处理期间承受更均匀的电场，将贴壁生长型细胞酶解为细胞悬液，然后取 70 μl 细胞悬液于电击杯中，此时大部分细胞将处于场强更加均匀的电击杯中间区域，并对其进行相应的 nsPEF 处理。对照组设置为将同等体积不加 MWCNTs 的细胞悬液加入电击杯但是不对其进行 nsPEF 处理。脉冲处理后，利用 CCK-8 试剂盒测量各个实验组的细胞活性，相关操作与 MWCNTs 毒性实验相同。
1.6 数据的统计学分析
采用 OriginPro 软件对数据进行统计学分析，数据均用 x(均值)±s(标准差)表示，利用单因素方差分析评估实验数据的显著性差异。P<0.05 为实验数据具有显著性差异。
2 结果
2.1 MWCNTs 毒性
为了将 MWCNTs 引入到 nsPEF 杀伤细胞的研究中，必须保证其对细胞具有低毒性，即高的生物相容性。A375 细胞生长于含有不同浓度 MWCNTs 的环境中，通过测量 MWCNTs 对细胞活性的影响确定合理的 MWCNTs 浓度。图 4 显示，当 MWCNTs 浓度为 300 μg/ml 时，细胞活性降低到 92%，并且随着 MWCNTs 浓度的升高，细胞活性越低，与对照 组 相 比 ， 组 间 及 组 内 数 据 都 具 有 统 计 学 差 异(P<0.05)。相反，当 MWCNTs 浓度小于或等于 200 μg/ml 时，细胞活性几乎没有变化，表明在此浓度范围内，MWCNTs 对细胞活性无影响，与对照组相比，组间及组内数据都不具有统计学差异(P>0.05)。即后续 nsPEF 处理 A375 细胞所用 MWCNTs 浓度小于或等于 200 μg/ml 即可。
2.2 细胞活性随不同脉冲参数的变化规律
设定 nsPEF 处理 A375 细胞时的 MWCNTs 浓度为无毒性时的最大值，即 200 μg/ml，在此基础上通过改变场强、脉宽、脉冲个数，研究 MWCNTs 联合 nsPEF 处理肿瘤细胞的剂量效应，并建立细胞活性与单因素间的拟合公式。图 5 显示了场强、脉宽、脉冲个数等单因素对细胞活性的影响结果。实验结果以柱状图和折线图叠加在一起的方式展示，红色折线(实线)和蓝色折线(虚线)分别表示不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的实验结果变化趋势。图例中“–MWCNTs”和“+MWCNTs”分别指“不加 MWCNTs”以及“加 MWCNTs”。与不加 MWCNTs 的结果相比，加入 MWCNTs 可以明显降低细胞活性，但并没有影响细胞活性随单因素变化的下降规律。图 5(a)表明，当固定脉宽 300 ns、脉冲个数 100 个时，细胞活性随场强呈现 S 型衰减;图 5(b)表明，当固定场强 6 kV/cm、脉冲个数 100 个时，细胞活性随脉宽呈现 S 型衰减;图 5(c)表明，当固定场强 6 kV/cm、脉宽 300 ns 时，细胞活性随脉冲个数呈现指数型衰减。
为了更清晰地表明并且预测细胞活性随各个脉冲参数的变化趋势，采用 logistic 回归模型拟合实验数据以得到细胞活性的输入输出公式。 Logistic 回归模型几乎已经成为流行病学和医学中最常用的分析方法之一，尤其适合根据危险因素预测某疾病发生的概率。Cole 在研究微生物热失活时针对细菌存活率随热处理时间呈 S 型曲线下降的趋势提出了对应的 logistic 模型[14]，此模型也适用于指数衰减型曲线的拟合，相关公式为： 0 10 1 exp(4 ( log ( ))/( )) 10 t t S t (1)其中，t 为自变量，S´为观察到的生物学效应，参数 α 和分别代表曲线上渐近线(t=0)和下渐近线(t→∞)对应的细菌存活率的对数，δ 和 t0 分别表示曲线的最大斜率以及最大斜率所对应的横坐标位置。根据图 5 所示结果，细胞活性在脉冲参数为低剂量时几乎没有变化，接近于 100，即曲线上渐近线为 100，所以 α 的值可以由下式计算得出： 10 log (100) 2 (2)修正后的 logistic 模型公式为： 0 10 2 2 1 exp(4 ( log ( ))/( 2)) 10 t t S t (3)公式(3)中的参数含义与公式(1)一致。利用 Matlab 对实验数据进行一元非线性拟合可以得到公式(3)中三个未知参数的最优值以及拟合准确度 R 2，从而可以确定曲线的函数关系式，对应的拟合曲线和 R 2 见图 6。红色曲线(实线)和蓝色曲线(虚线)分别代表用 logistic 模型对不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的实验结果拟合得到的曲线。R 2 被用来评价模型的拟合准确度，其介于 0 到 1 之间，越接近于 1，说明所选模型与实验结果的匹配度越高。
由各曲线的 R 2 可知，采用 logistic 模型可以较为准确地描述实验规律。图 6 表明，细胞活性随场强、脉宽变化时具有阈值效应，即在低脉冲剂量下，细胞活性几乎不变，当脉冲剂量高于某个阈值后，细胞活性开始急剧下降，并且在下降到一定程度后开始饱和。相比之下，细胞活性随脉冲个数的增加没有明显的阈值变化点，但是也会随着脉冲个数的增加出现饱和趋势。
2.3 细胞活性与多因素间的归一化关系
为了进一步分析有无 MWCNTs 时场强、脉宽、脉冲个数三个参数与细胞活性的综合关系，假设细胞活性 S´与注入的脉冲能量密度 σE2 τN 有关，σ 为细胞悬液的电导率，当 σ 为一定值时： 0.5 S F E N (4)式中，F 为 E(τN) 0.5 的函数。以脉冲注入能量 E(τN) 0.5 为横坐标，细胞活性为纵坐标，绘出如图 7 所示的散点图，脉冲注入能量为 0 时即为对照组。图 7 中红色曲线(实线)与蓝色曲线(虚线)代表的含义与图 6 类似。图 7 表明，不论有无 MWCNTs，细胞活性与脉冲注入能量 E(τN) 0.5之间整体呈现 S 型的变化规律。即当脉冲注入能量很小且未达到所需的能量阈值时，基本不影响细胞活性;当脉冲注入能量超过阈值点时，细胞活性开始出现急剧下降，最后稳定在某一饱和值，此时细胞活性随脉冲注入能量的增大几乎没有变化。
基于 logistic 模型，得到细胞活性 S´与脉冲注入能量 E(τN) 0.5 的拟合曲线，如图 7 所示。表 2 为对应拟合曲线的参数最优值及拟合度。 由 logistic 模型中参数 ω 的物理含义可得，细胞活性在不加 MWCNTs 和加 MWCNTs 时所达到的饱和值分别为 10 0.559 9=3.63 和 10 0.538 6=3.46，两者之间并无明显区别，均近似为 3.5。细胞活性阈值约为 90(曲线下降阶段距离上渐近线 10%的位置)，饱和值约为 12(曲线下降阶段距离下渐近线 10%的位置)[15]。细胞活性在不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的情况下达到阈值所需要的注入剂量分别为 654 和 540，达到饱和值所需要的注入剂量分别为 1 190 和 912。即 MWCNTs 的引入可以同时减小杀伤细胞所需的起始能量阈值和饱和能量值。
3 讨论
3.1 不同浓度 MWCNTs 对细胞活性的影响
不同浓度MWCNTs的毒性实验表明，MWCNTs 诱导的细胞毒性具有剂量依赖性，即MWCNTs浓度越高，毒性越强。需要注意的是，除了MWCNTs，在碳纳米管的制备过程中，还残留有少量的催化剂和非离子表面活性剂[9,16]。其中，非离子表面活性剂主要用于解决碳纳米管的团聚问题。研究表明， MWCNTs的毒性主要由残留催化剂以及分散剂造成，并且残留物的浓度越高，对细胞活性的影响越明显[17,18]，这与本实验的结果相符。
3.2 细胞活性随不同脉冲参数的变化规律
细胞在正常的生理机能状况下，由于其膜的选择通透性会阻止大分子物质的通过，从而维持细胞内外环境的平衡。但是当细胞暴露于电场中，电荷会向细胞膜两侧积累，形成跨膜电位。当跨膜电位超过细胞膜的绝缘强度时，细胞膜上会产生微孔 [19]，打破细胞内外环境的平衡，从而影响细胞的正常生长状态。对于单个球形细胞，不可逆电穿孔所需要的外加场强阈值Et可以表示为[20]：
E d (5)其中，Δφ 为细胞膜阈值跨膜电位，d 是球形细胞的直径，θ 是细胞膜上特定位置的法线方向与外加电场 E 方向的夹角。除了外加电压要达到阈值，电穿孔现象是否可以发生还取决于脉冲持续时间[21]。如果施加的脉冲电压持续时间太短，在脉冲电场撤去后细胞膜两侧的电荷分布会重新恢复到初始状态，无法产生电穿孔效应。球形细胞达到阈值跨膜电位所需要的最短脉冲持续时间 τ´(时间常数)为[22]： 2 1 ( ) 2 Cd (6) ρ1 和 ρ2 分别为细胞外液和细胞质的电阻率，C 为细胞膜的等效电容。综上所述，根据电穿孔原理可知，电穿孔效应的产生不仅要求外加电压超过一定阈值，还要求脉宽达到细胞膜的充电时间常数。这也解释了图 6 中为 什 么 当 场 强 或 者 脉 宽 过 低 时 ， 不 论 有 无 MWCNTs，nsPEF 几乎对细胞活性无影响，从而细胞活性随场强和脉宽的增加均呈现 S 型变化。细胞活性随脉冲个数的变化几乎没有阈值效应，而是呈现指数型变化，主要是因为当改变脉冲个数时，场强和脉宽的固定值达到了电穿孔所需要的阈值。脉冲个数越多，脉冲电场造成的细胞穿孔状态维持时间越久，细胞内外的物质交换越充分，也越容易破坏细胞的生存环境，从而造成细胞死亡。
3.3 MWCNTs 增强 nsPEF 杀伤细胞效果的机制
CNTs是一种具有特殊结构(径向尺寸为纳米级，轴向尺寸为微米级，管子两端基本上都封口)的一维量子材料，主要由呈六边形排列的碳原子构成数层到数十层的同轴圆管。CNTs具有独特的电学特性，呈现良好的金属性(电导率约为104 S·cm-1)，研究表明，其载流能力是铜线的1 000倍[23]，使其可以在癌细胞附近形成三维导电基质。将具有一维结构的单根CNTs插入到幅值为E0的均匀电场区域中，会在CNTs的尖端产生场强增强效果。CNTs尖端的电场增强效果可以通过以下公式估算[24]： tip 0 E L E D (7) Etip 为 CNTs 尖端的电场强度，β 是一个常数， L 和 D 分别表示 CNTs 的长度和外径，CNTs 的高纵横比(L/D)解释了为什么其可以很好地集聚场强，从而促进电穿孔的效果。除此之外，研究表明处于电磁场中的 CNTs 还可以通过与细胞膜直接物理接触对其产生机械破坏作用[11,25]。CNTs 在未施加电场之前将会因为其大比表面积和强烈的表面静电作用随机吸附到细胞膜周围，并且部分 CNTs 还会与细胞膜磷脂结合，此时 CNTs 的存在对细胞形态无影响。但当施加电场后， CNTs 会因为在电磁场中受到极化作用而旋转，直至与外加电场方向相同，在 CNTs 的旋转过程中，其尖端受到的介电泳力将因为机械作用引起细胞膜变形和穿孔。总之，CNTs 的局部电场增强能力和物理破坏能力可以有效提高 nsPEF 杀伤癌细胞的效果。
4 结论
本文，我们在确定 MWCNTs 安全浓度的基础上探究了 MWCNTs 联合 nsPEF 影响离体 A375 细胞活性的剂量效应。细胞活性随各个脉冲参数的变化整体呈现剂量越大，活性越低的规律。细胞活性随场强、脉宽的变化具有阈值效应，但是随脉冲个数的变化却没有明显的阈值效应，并且随各个脉冲参数的变化都呈现饱和效应。细胞活性与脉冲能量密度的归一化关系呈 S 型规律。具有良好电学特性和一维结构的 MWCNTs 不影响上述变化规律，但是可以显著增强 nsPEF 对肿瘤细胞的杀伤效果，对提高临床治疗过程中的电气安全性具有重要意义。
参考文献
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