摘要:生物素与肿瘤细胞表面的生物素受体结合ꎬ通过受体介导的内吞作用将共轭物摄入细胞内ꎬ二硫键在肿瘤细胞中能够开链ꎬ释放出活性物质ꎬ实现靶向性给药ꎬ从而大大降低传统化疗药物因缺乏对肿瘤细胞的选择性而引起的毒副作用ꎮ 用巯基置换的方式ꎬ合成含有二硫键的连接链ꎻ用将羧酸基团转化为酰肼基团的方法ꎬ将生物素转化为生物素酰肼ꎻ选用具有抗多药耐药性的含氟紫杉烷 SB￣T￣12854 作为细胞毒分子ꎻ通过含有二硫键的连接链将含氟紫杉烷化合物 SB￣T￣12854 与生物素酰肼进行偶连ꎬ形成一种新型的紫杉烷生物素共轭物ꎮ
关键词:肿瘤靶向型给药系统ꎻ紫杉烷ꎻ生物素ꎻ共轭物
0 引言
紫杉醇和多西紫杉醇作为第一代紫杉烷类抗肿瘤药物在临床治疗中被广泛应用ꎬ主要用于治疗乳腺癌、子宫癌、非小细胞型肺癌等ꎮ 第一代紫杉烷类药物作为传统的化疗药物ꎬ对于正常组织细胞和肿瘤细胞的选择性差ꎬ在杀伤肿瘤细胞的同时对正常组织细胞同样具有毒副作用ꎮ 因此ꎬ多种紫杉醇靶向型肿瘤给药系统被研发出来ꎮ 例如 Cell Therapeutics 公司研发的聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel poliglumexꎬXyotax)是紫杉醇与生物可降解聚谷氨酸聚合物的结合体ꎮ 这种聚合物技术创造出一种新化学实体ꎬ 能将更多更有效的活性化疗药选择性地输送到肿瘤部位ꎮ [1] Protarga 公司研发的 Taxoprexin(DHA￣paclitaxel)采用紫杉醇和人体必需脂肪二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acidꎬDHA)相结合ꎬ临床前试验表明ꎬ肿瘤细胞由于代谢的加快对脂肪酸的摄取量也随之增加ꎬ因此将化疗药物与脂肪酸结合ꎬ可以增加化疗药物对肿瘤细胞的靶向性ꎬ从而增强治疗效果ꎮ [2]肿瘤的快速增殖需要大量的营养物质和维生素ꎬ因此在肿瘤细胞表面过表达与其相应的受体ꎬ能够转运营养物质或维生素进入到肿瘤细胞中供给肿瘤生长ꎮ 利用肿瘤细胞表面过表达特殊的抗原ꎬ将与其特异性结合的单克隆抗体与紫杉醇连接ꎬ可以有效地别肿瘤细胞ꎬ从而达到靶向性给药的目的ꎮ [3￣4]
肿瘤靶向型的药物传输系统一般是由肿瘤识别部分和细胞毒分子直接连接ꎬ或者两部分通过一个链相连形成一个共轭化合物ꎬ这个共轭化合物可以看作前药ꎬ不具有活性ꎬ这也就意味着该共轭物能够在血液循环中稳定的存在ꎬ当进入到肿瘤组织后能够高效地释放出活性细胞毒分子ꎬ从而达到治疗的目的ꎮ 基于上述原理ꎬ肿瘤识别部分选用生物素与新型的紫杉烷类衍生物进行偶联ꎬ生物素能够与肿瘤表面的受体特异性结合ꎬ通过受体介导的内吞作用进入到肿瘤细胞中ꎬ [5]在肿瘤细胞的环境中水解释放出活性细胞毒分子ꎮ
基于谷胱甘肽在肿瘤细胞中的含量高于血液中 1 000 倍以上ꎬ [6] 设计开发了一个含有二硫键的简单侧链将紫杉烷类化合物与生物素连接起来ꎬ可以确保共轭物在血液循环时稳定ꎬ进入肿瘤细胞后ꎬ二硫键在谷胱甘肽的作用下发生开链ꎬ释放出活性细胞毒分子从而会发挥作用(见图 1)ꎮ [7] 合成的紫杉烷类衍生物ꎬ在体外对于多药耐药型的肿瘤细胞株的活性高于第一代紫杉烷类药物 2￣3 个数量级ꎬ [8]其中二氟乙烯基取代 C3'位得到的一系列紫杉烷衍生物活性良好ꎬ [9]选取其中具有代表性的含氟化合物 SB￣T￣12854 作为活性细胞毒分子ꎬ与生物素通过已经验证的二硫链相连接ꎬ形成一个新的 SB￣T￣12854￣生物素共轭物(见图 2)ꎮ
1 材料与方法
1.1 实验材料
化合物 SB￣T￣12854 由本课题组制备ꎬ结构经过1H￣NMRꎬMS 确证ꎮ 实验中相关化学试剂均购于 Aldrich和 Sigma 试剂有限公司ꎮ 甲醇、二氯甲烷等溶剂需要提前做无水处理ꎬ反应监测采用的是 TLC 法ꎬ薄层层析硅胶板的型号为 0.25 mm E. Merck (60 F254 )ꎻ柱层析分离纯化使用的是快速制备仪器 Biotage Isolera Iꎬ所用的硅胶为 300￣400 meshꎮ 反应收率为过柱纯化后计算而得ꎮ1H￣NMR 和13 C￣NMR 采用 500MHz 型 BrukerAvanceⅢ核磁共振波谱仪器ꎮ 质谱数据采用离子肼质量分析器 Thermo Electron LCQ Deca XP / Ad。
1. 2 实验方法
紫杉烷-生物素共轭物的合成ꎬ可以分为三部分ꎬ第一部分合成含有二硫键的连接链ꎬ第二部分将生物素转化为生物素酰肼ꎬ第三部分将通过含有二硫键的连接链将含氟紫杉烷化合物 SB￣T￣12 854 与生物素酰肼进行偶连ꎬ形成最终的共轭物ꎮ 二硫链部分的设计合成是基于其在肿瘤组织中受到谷胱甘肽的进攻ꎬ二硫键会发生开链ꎬ游离的巯基会进一步发生亲核进攻释放出活性细胞毒分子ꎬ该部分的合成主要采用巯基置换的方式进行合成ꎮ 生物素部分的改造是将羧酸基团转化为酰肼基团ꎬ主要是有助于其与二硫链的缩合连接ꎮ共轭物的制备首先将紫杉烷 SB￣T￣12 854 的 2’羟基与二硫链的羧酸基团进行酯化缩合ꎬ再与生物素部分进行偶连ꎬ最终得到目标化合物(见图 3)。
反应条件:(a)高锰酸钾ꎬ二氯甲烷ꎬ室温ꎻ(b)硫脲ꎬ氢溴酸ꎬ70 ℃ꎻ(c)氢氧化钠溶液ꎬ室温ꎻ( d)乙醇ꎬ回流ꎻ( e)三异丙基氯硅烷ꎬ三乙胺ꎬ二氯甲烷ꎬ室温ꎻ(f)30%双氧水溶液ꎬ乙醇ꎬ室温ꎻ(g)氢氧化锂ꎬ水/ 四氢呋喃ꎬ60 ℃ꎻ(h)乙醇ꎬ室温ꎻ(i)氯化亚砜ꎬ甲醇ꎬ回流ꎻ(j)水合肼ꎬ甲醇ꎬ回流ꎻ(k)NꎬN’￣二异丙基碳二亚胺ꎬ4￣二甲氨基吡啶ꎬ二氯甲烷ꎬ室温ꎻ( l)70%氢氟酸吡啶溶液ꎬ乙腈/ 吡啶ꎬ0 ℃ꎻ(m)N￣羟基琥珀酰亚胺ꎬNꎬN’￣二异丙基碳二亚胺ꎬ4￣二甲氨基吡啶ꎬ二氯甲烷ꎬ室温ꎻ( n)二甲基亚砜ꎬ室温ꎮ
1.2.1 二硫链部分
1.2.1.1 化合物 1 的制备
2￣巯基吡啶(15 gꎬ135 mmol)溶解在150 mL 的二氯甲烷中ꎬ向反应液中缓慢地加入高锰酸钾(62 gꎬ405 mmol)ꎬ加料完毕后剧烈搅拌ꎬTLC 监测反应ꎮ 反应结束后ꎬ过滤浓缩反应液ꎬ得到无色针状晶体化合物 1ꎮ
1.2.1.2 化合物 2 的制备
5￣甲基戊内酯(2 0 gꎬ20 mmol)溶解于 15 mL 的氢溴酸中ꎬ在 70 ℃下ꎬ向反应液中缓慢地加入硫脲(8 0 gꎬ100 mmol)ꎬ加料完毕后回流过夜反应ꎮ 反应液冷却后用 50 mL 冷水稀释ꎮ 水相分别用乙醚和二氯甲烷洗涤多次ꎮ 然后用 10 mol / L 的氢氧化钠溶液调节水相的 pH 为 13ꎮ 收集水相ꎬ回流剧烈搅拌 2 hꎮ 反应结束后ꎬ反应液冷却至室温ꎬ使用 1 mol / L 盐酸调节反应液的 pH 为 2ꎮ 水相使用二氯甲烷(3×50 mL)进行萃取ꎬ合并有机相ꎬ先后经水ꎬ饱和食盐水洗涤ꎬ无水硫酸镁干燥ꎬ得到无色油状化合物 2ꎮ
1.2.1.3 化合物 3 的制备
化合物 1(13 7 gꎬ62 6 mmol) 溶解于 250 mL 无水乙醇中ꎬ氮气保护ꎬ加热至反应液回流ꎮ 化合物 2 (1 54 gꎬ11 5 mmol)溶解于 100 mL 的无水乙醇中ꎬ向反应液中缓慢的加入ꎮ TLC 监测反应ꎬ待反应结束后ꎬ反应液冷却至室温ꎬ蒸干溶剂ꎬ残留物直接过柱分离纯化得到黄色油状物化合物 3ꎮ
1.2.1.4 化合物 4 的制备
化合物 3(1 59 gꎬ6 53 mmol)溶解于 35 mL 的二氯甲烷中ꎬ向反应液中加入 1 4 mL 的三乙胺ꎬ在 0 ℃下反应ꎬ向反应液中滴加三异丙基氯硅烷(2 5 mLꎬ9 8 mmol)ꎬTLC 检测反应进行ꎮ 反应结束后ꎬ向反应液中加入 5 mL 的饱和氯化铵溶液停止反应ꎬ加入 100 mL 水稀释ꎬ接着用二氯甲烷萃取水相ꎬ合并有机相ꎬ饱和食盐水洗涤ꎬ无水硫酸镁干燥ꎬ浓缩过柱分离得到无色油状物化合物 4ꎮ
1.2.1.5 化合物 5 的制备
2￣溴酸苯并噻吩(2 gꎬ20 mmol) 溶解于 40 mL 无水乙醇中ꎬ向反应液中滴加 30% 双氧水( 7 2 mLꎬ40 mmol)ꎮ 反应液在室温下搅拌反应ꎬTLC 监测反应进行ꎮ 待反应结束后ꎬ先向反应液中加入 50 mL 水稀释ꎬ然后用二氯甲烷萃取ꎬ合并有机相ꎬ饱和食盐水洗涤后ꎬ无水硫酸镁干燥ꎬ过滤浓缩ꎬ过柱分离纯化得到淡黄色的油状化合物 5ꎮ
1.2.1.6 化合物 6 的制备
化合物 5(1 65 gꎬ11 mmol)溶解于 50 mL 四氢呋喃中ꎬ在 60 ℃下ꎬ向反应液中缓慢地滴加氢氧化锂溶液 (1 58 gꎬ66 mmol)ꎮ TLC 监测反应ꎬ待反应结束后ꎬ先将反应液冷却至室温ꎬ用 1 mol / L 盐酸调节反应液的pH 至 2ꎬ然后用乙酸乙酯多次萃取ꎮ 合并有机相ꎬ饱和食盐水洗涤后ꎬ经无水硫酸镁干燥ꎬ过滤浓缩ꎬ过柱分离纯化得到淡黄色固体化合物 6ꎮ
1.2.1.7 化合物 7 的制备
化合物 4(1 05 gꎬ2 63 mmol)和化合物 6(0 74 gꎬ4 4 mmol)溶解于 10 mL 的四氢呋喃中ꎬ0 ℃下反应ꎬTLC 监测反应进行ꎮ 待反应结束后ꎬ蒸除多余溶剂直接过柱分离纯化ꎬ得到无色油状物化合物 7ꎮ
1.2.2 生物素部分
1.2.2.1 化合物 8 的制备
生物素(300 mgꎬ1 20 mmol)溶解于 3 mL 甲醇中ꎬ冷却至 0 ℃ꎬ向反应液中缓慢的加入 0 3 mL 的二氯亚砜ꎬ在室温下反应过夜ꎮ 反应结束后ꎬ浓缩反应液ꎬ残余物用正己烷润洗得到白色固体化合物 8ꎮ
1.2.2.2 化合物 9 的制备
化合物 8(150 mgꎬ0 58 mmol)溶解于 2 mL 的甲醇中ꎬ向反应液中滴加 0 2 mL 的水合肼ꎮ 回流反应 8 h后ꎬ待反应液冷却至室温后ꎬ蒸出多余的甲醇ꎬ先后用正己烷和乙醚洗涤残余物ꎬ得到白色固体化合物 9ꎮ
1.2.3 SB￣T￣12854￣二硫链￣生物素偶连
SB￣T￣12854 由本课题组以 10￣去乙酰基巴卡亭 III 通过半合成的方式制备ꎬ结构经 MS 和1H￣NMR 确证ꎮ
1.2.3.1 化合物 10 的制备
化合物 7(78 mgꎬ0 17 mmol)溶解于 4 mL 的二氯甲烷中ꎬ先后向反应液中加入 4￣二甲氨基吡啶 DMAP (6 mgꎬ0 049 mmol)ꎬ接着加入 Nꎬ N￣二异丙基碳二亚胺 DIC(0 027 mLꎬ0 17 mmol)ꎬ反应 10 min 后ꎬ向反应液中加入化合物 SB￣T￣12854(85 mgꎬ0 098 mmol)ꎬTLC 监测反应进行ꎮ 待反应结束后ꎬ蒸除残余溶剂ꎬ过柱分离纯化得到白色固体化合物 10ꎮ
1.2.3.2 化合物 11 的制备
化合物 10(88 mgꎬ0 067 mmol)溶解于 6 mL 乙腈/ 吡啶( v ∶ v = 1∶1)中ꎬ冷却至 0 ℃ꎬ向反应液中加入1 mL70%的 HF / Py 溶液ꎮ 在室温下过夜反应ꎬ反应结束后ꎬ向反应液中加入 20 mL 的碳酸氢钠溶液中和过量的氢氟酸ꎬ接着多次乙酸乙酯萃取ꎮ 合并有机相ꎬ多次使用饱和硫酸铜溶液洗涤过量的吡啶ꎬ然后经饱和食盐水洗涤ꎬ无水硫酸镁干燥ꎬ过滤浓缩ꎬ过柱分离纯化ꎬ得到白色固体化合物 11ꎮ
1.2.3.3 化合物 12 的制备
化合物 11(67 mgꎬ0 058 mmol)和 N￣羟基琥珀酸(14 mgꎬ0 116 mmol)溶解于 4 mL 的二氯甲烷中ꎬ冷却至 0 ℃ꎬ先后向反应液中加入 DIC(0 012 mLꎬ0 075 mmol)和 DMAP(6 mgꎬ0 049 mmol)ꎮ 反应在室温下搅拌过夜ꎬ反应结束后ꎬ直接过柱分离纯化得到白色固体化合物 12ꎮ
1.2.3.4 化合物 13 的制备
化合物 9(13 mgꎬ0 052 mmol)和化合物 12(53 mgꎬ0 043 mmol)溶解于 1 mL 的 DMSO 中ꎬTLC 监测反应进行ꎬ待反应结束后ꎬ直接过柱分离纯化得到白色固体化合物 13ꎮ2 结果与分析化合物 3 和化合物 7 由于结构中有酸性基团和二硫键的存在导致化合物不稳定容易分解ꎬ因此需要直接进行下一步反应ꎬ或短期在低温下保存ꎮ 在整个合成过程中所用的中间体以及最终的目标产物的结构均经过 MS 和 NMR 的确证ꎮSB￣T￣12854 为白色固体ꎮ ESI￣MS m/ z: 864 8 (M+H) + . 1H NMR (500 MHzꎬ CDCl3 ) δ 8 12 (dꎬ J =7 5 Hzꎬ 2H)ꎬ 7 61 (tꎬ J = 7 4 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 50 (tꎬ J = 7 7 Hzꎬ 2H)ꎬ 6 36￣6 19 (mꎬ 2H)ꎬ 5 66 (dꎬ J = 7 0Hzꎬ 1H)ꎬ 5 06￣4 92 (mꎬ 2H)ꎬ 4 88 ( dꎬ J = 8 7 Hzꎬ 1H)ꎬ 4 64￣4 51 (mꎬ 1H)ꎬ 4 51￣4 40 (mꎬ 1H)ꎬ4 36￣4 25 (mꎬ 2H)ꎬ 4 18 (dꎬ J = 8 4 Hzꎬ 1H)ꎬ 3 81 ( dꎬ J = 7 0 Hzꎬ 1H)ꎬ 3 53 ( dꎬ J = 5 4 Hzꎬ 1H)ꎬ3 21 (sꎬ 1H)ꎬ 3 04 ( sꎬ 3H)ꎬ 2 96 ( sꎬ 3H)ꎬ 2 53 ( dddꎬ J = 14 9ꎬ 9 6ꎬ 6 7 Hzꎬ 1H)ꎬ 2 45￣2 33 (mꎬ4H)ꎬ 2 33￣2 23 (mꎬ 1H)ꎬ 1 97￣1 83 (mꎬ 4H)ꎬ 1 67 (sꎬ 3H)ꎬ 1 30 (sꎬ 9H)ꎬ 1 25 (dꎬ J = 1 7 Hzꎬ 3H)ꎬ1 16 (sꎬ 3H).
化合物 1(27 2gꎬ92%)为无色针状晶体ꎮ ESI￣MS m/ z: 221 3 (M+H) + . 1H NMR (500 MHzꎬ CDCl3 ) δ 8 45(mꎬ 2H)ꎬ 7 60 (mꎬ 4H)ꎬ 7 10 (mꎬ 2H).
化合物 2(1 9 gꎬ 71%)为无色油状物ꎮ ESI￣MS m/ z: 135 1 (M+H) + . 1H NMR (500 MHzꎬ CDCl3 ) δ 11 2 (sꎬ 1H)ꎬ 2 91 (mꎬ 1H)ꎬ 2 49 (mꎬ 2H)ꎬ 1 94 (mꎬ 1H)ꎬ 1 73 (mꎬ 1H)ꎬ 1 47 ( dꎬ J = 6 8 Hzꎬ1H)ꎬ 1 32 (dꎬ 6 8 Hzꎬ 3H).
化合物 3(2 2 gꎬ 77%)为黄色油状物ꎮ m/ z: 244 3(M+H) + . 1H NMR (500 MHzꎬ CDCl3 ) δ 9 6 (sꎬ1H)ꎬ 8 44 (mꎬ 1H)ꎬ 7 63 (mꎬ 1H)ꎬ 7 22 (mꎬ 1H)ꎬ 7 08 (mꎬ 1H)ꎬ 3 0 (mꎬ 1H)ꎬ 2 5 (tꎬ J = 8 1 Hzꎬ2H)ꎬ 1 97 (mꎬ 1H)ꎬ 1 92 (mꎬ 1H)ꎬ 1 31 (dꎬ J = 6 9 Hzꎬ 3H).
化合物 4(2 4 gꎬ 94%)为无色油状物ꎮ ESI￣MS m/ z: 400 8 (M+H) + . 1H NMR (500 MHzꎬ CDCl3 ) δ 8 45 (mꎬ 1H)ꎬ7 63 (mꎬ 1H)ꎬ 7 2 (mꎬ 1H)ꎬ 7 08 (mꎬ 1H)ꎬ 3 04 (mꎬ 1H)ꎬ 2 51 (tꎬ J = 8 1 Hzꎬ 2H)ꎬ1 97 (mꎬ 1H)ꎬ 1 81 (mꎬ 1H)ꎬ 1 31 (dꎬ J = 6 9 Hzꎬ 3H)ꎬ 1 25 (mꎬ 21H).
化合物 5(2 3 gꎬ 77%)为淡黄色固体ꎮ ESI￣MS m/ z: 151 8 (M+H) + . 1H NMR (500 MHzꎬ CDCl3 ) δ 7 40￣7 28 (mꎬ 4H)ꎬ 4 04 (sꎬ 2H).
化合物 6(1 9 gꎬ 84%)为淡黄色固体ꎮ ESI￣MS m/ z: 169 5 (M+H) + . 1H NMR (500 MHzꎬ CDCl3 ) δ 7 40 (mꎬ 1H)ꎬ 7 26￣7 16 (mꎬ 3H)ꎬ 3 82 (sꎬ 2H)ꎬ 3 49 (sꎬ 1H).
化合物 7(0 59gꎬ35%)为无色油状物ꎮ ESI￣MS m/ z: 457 6 (M+H) + . 1H NMR (500 MHzꎬ CDCl3 ) δ 7 72 (dꎬ J = 7 8 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 25￣7 19 (mꎬ 1H)ꎬ 7 13 (dꎬ J = 4 2 Hzꎬ 2H)ꎬ 3 82 (sꎬ 2H)ꎬ 2 83 (ddꎬ J =13 6ꎬ 6 8 Hzꎬ 1H)ꎬ 2 34 (dtꎬ J = 8 2ꎬ 6 5 Hzꎬ 2H)ꎬ 1 93￣1 81 (mꎬ 1H)ꎬ 1 74 (tdꎬ J = 14 6ꎬ 6 8 Hzꎬ1H)ꎬ 1 25￣1 13 (mꎬ 6H)ꎬ 1 03￣0 91 (mꎬ 18H).
化合物 8(287 mgꎬ93%)为白色固体ꎮ ESI￣MS m/ z: 259 1(M+H) + . 1H NMR (CD3OD) δ 4 48 (mꎬ1H)ꎬ 4 30 (mꎬ 1H)ꎬ 3 65 (sꎬ 3H)ꎬ 3 20 (mꎬ 1H)ꎬ 2 92 (ddꎬ J = 4 8ꎬ 12 6ꎬ 1H)ꎬ 2 70 ( dꎬ J = 12 6Hz)ꎬ 2 34 (tꎬ J = 7 2 Hzꎬ 2H)ꎬ 1 70￣1 53 (mꎬ 4H)ꎬ 1 45 (qꎬ J = 7 2 Hzꎬ 2H).
化合物 9(135 mgꎬ90%)为白色固体ꎮ ESI￣MS m/ z: 259 1 (M+H) + . 1H NMR (CD3OD) δ 4 49 (mꎬ1H)ꎬ 4 32 (mꎬ 1H)ꎬ 3 22 (mꎬ 1H)ꎬ 2 87 (ddꎬ J = 4 5ꎬ 12 6 Hzꎬ 1H)ꎬ 2 67 (dꎬ J = 12 6 Hzꎬ 1H)ꎬ 2 11 (tꎬ J = 7 2 Hzꎬ 2H)ꎬ 1 70￣1 38 (mꎬ 4H)ꎬ 1 30 (qꎬ J = 7 2 Hzꎬ 2H).
化合物 10(88 mgꎬ69%)为白色固体ꎮ ESI￣MS m/ z: 1303 6 (M+H) + . 1H NMR (500 MHzꎬ CDCl3 ) δ 8 14 (dꎬ J = 7 6 Hzꎬ 2H)ꎬ 7 83 ( dꎬ J = 7 8 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 62 ( tꎬ J = 7 4 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 52 ( tꎬ J = 7 6 Hzꎬ2H)ꎬ 7 36￣7 31 (mꎬ 1H)ꎬ 7 32￣7 25 (mꎬ 4H)ꎬ 6 33￣6 22 (mꎬ 2H)ꎬ 5 68 ( dꎬ J = 7 0 Hzꎬ 1H)ꎬ 5 12￣4 92 (mꎬ 4H)ꎬ 4 49 (ddꎬ J = 10 9ꎬ 6 7 Hzꎬ 1H)ꎬ 4 32 (dtꎬ J = 16 7ꎬ 8 5 Hzꎬ 2H)ꎬ 4 19 (dꎬ J = 8 4 Hzꎬ1H)ꎬ 4 13 (ddꎬ J = 16 3ꎬ 7 7 Hzꎬ 1H)ꎬ 4 00 ( ddꎬ J = 16 3ꎬ 8 4 Hzꎬ 1H)ꎬ 3 82 ( dꎬ J = 7 0 Hzꎬ 1H)ꎬ3 25 (sꎬ 1H)ꎬ 3 05 (sꎬ 3H)ꎬ 2 97 (sꎬ 4H)ꎬ 2 60￣2 51 (mꎬ 1H)ꎬ 2 44 (dtꎬ J = 6 5ꎬ 4 6 Hzꎬ 2H)ꎬ 2 42￣2 32 (mꎬ 4H)ꎬ 2 24 (ddꎬ J = 15 2ꎬ 8 9 Hzꎬ 1H)ꎬ 1 95 (sꎬ 6H)ꎬ 1 68 ( sꎬ 4H)ꎬ 1 32 ( dꎬ J = 3 8 Hzꎬ12H)ꎬ 1 30￣1 23 (mꎬ 6H)ꎬ 1 08 (dꎬ J = 7 5 Hzꎬ 19H).
化合物 11(67 mgꎬ87%)为白色固体ꎮ ESI￣MS m/ z: 1147 3 (M+H) + . 1H NMR (500 MHzꎬ CDCl3 ) δ 8 13 (sꎬ 2H)ꎬ 7 85 (ddꎬ J = 15 0ꎬ 7 5 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 63 (tꎬ J = 7 4 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 51 (dꎬ J = 17 6 Hzꎬ 2H)ꎬ7 35 (ddꎬ J = 16 2ꎬ 8 0 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 25 (dꎬ J = 6 9 Hzꎬ 3H)ꎬ 6 37￣6 22 (mꎬ 2H)ꎬ 5 69 (dꎬ J = 6 3 Hzꎬ1H)ꎬ 5 24 (dꎬ J = 26 6 Hzꎬ 1H)ꎬ 5 19￣4 97 (mꎬ 3H)ꎬ 4 46 (sꎬ 2H)ꎬ 4 34 ( dꎬ J = 7 3 Hzꎬ 1H)ꎬ 4 18 (dꎬ J = 18 0 Hzꎬ 1H)ꎬ 3 81 (dꎬ J = 7 6 Hzꎬ 1H)ꎬ 3 06 (sꎬ 3H)ꎬ 2 98 (sꎬ 3H)ꎬ 2 52 (sꎬ 3H)ꎬ 1 91 (tꎬJ = 13 4 Hzꎬ 4H)ꎬ 1 70 (sꎬ 4H)ꎬ 1 36 (dꎬ J = 7 2 Hzꎬ 9H)ꎬ 1 31￣1 21 (mꎬ 7H)ꎬ 1 18 (sꎬ 3H).
化合物 12(53 mgꎬ74%)为白色固体ꎮ ESI￣MS m/ z: 1244 3 (M+H) + . 1H NMR (300 MHzꎬ CDCl3 ) δ 8 13 (dꎬ J = 7 4 Hzꎬ 2H)ꎬ 7 82 ( dꎬ J = 7 5 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 62 ( tꎬ J = 7 3 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 51 ( tꎬ J = 7 6 Hzꎬ2H)ꎬ 7 43￣7 28 (mꎬ 3H)ꎬ 6 35￣6 17 (mꎬ 2H)ꎬ 5 67 ( dꎬ J = 6 9 Hzꎬ 1H)ꎬ 5 15￣4 88 (mꎬ 4H)ꎬ 4 47 ( ddꎬ J = 10 7ꎬ 6 9 Hzꎬ 1H)ꎬ 4 36 (ddꎬ J = 20 3ꎬ 8 6 Hzꎬ 2H)ꎬ 4 24￣4 14 (mꎬ 1H)ꎬ 4 11 (dꎬ J = 2 6 Hzꎬ1H)ꎬ 4 00 (dꎬ J = 17 1 Hzꎬ 1H)ꎬ 3 81 ( dꎬ J = 6 7 Hzꎬ 1H)ꎬ 3 04 ( sꎬ 3H)ꎬ 2 96 ( sꎬ 3H)ꎬ 2 85 ( sꎬ4H)ꎬ 2 68 (tꎬ J = 7 4 Hzꎬ 2H)ꎬ 2 61￣2 46 (mꎬ 1H)ꎬ 2 44￣2 17 (mꎬ 5H)ꎬ 2 12￣1 81 (mꎬ 7H)ꎬ 1 67 (sꎬ3H)ꎬ 1 33 (dꎬ J = 7 1 Hzꎬ 10H)ꎬ 1 28￣1 19 (mꎬ 5H)ꎬ 1 16 (sꎬ 3H).
化合物 13(46 mgꎬ79%)为白色固体ꎮ1H NMR (500 MHzꎬ CDCl3 ) δ 9 60 (sꎬ 1H)ꎬ 9 06 (dꎬ J = 17 2Hzꎬ 1H)ꎬ 8 10 (dꎬ J = 7 2 Hzꎬ 2H)ꎬ 7 79 (dꎬ J = 7 3 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 59 (tꎬ J = 7 4 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 48 (tꎬ J =7 2 Hzꎬ 2H)ꎬ 7 31 (ddꎬ J = 12 1ꎬ 4 3 Hzꎬ 1H)ꎬ 7 24 (dꎬ J = 6 9 Hzꎬ 2H)ꎬ 6 88 (sꎬ 1H)ꎬ 6 24 (dꎬ J =10 3 Hzꎬ 2H)ꎬ 6 05 (sꎬ 1H)ꎬ 5 66 (dꎬ J = 6 9 Hzꎬ 1H)ꎬ 5 32 (sꎬ 1H)ꎬ 5 11￣4 93 (mꎬ 3H)ꎬ 4 48￣4 40 (mꎬ 2H)ꎬ 4 40￣4 33 (mꎬ 1H)ꎬ 4 29 (dꎬ J = 8 1 Hzꎬ 2H)ꎬ 4 17 (dꎬ J = 8 4 Hzꎬ 1H)ꎬ 4 10 (ddꎬ J = 16 5ꎬ6 5 Hzꎬ 1H)ꎬ 4 00 (dꎬ J = 16 4 Hzꎬ 1H)ꎬ 3 87￣3 76 (mꎬ 2H)ꎬ 3 10 (ddꎬ J = 11 4ꎬ 6 8 Hzꎬ 1H)ꎬ 3 02 (sꎬ 3H)ꎬ 2 97￣2 90 (mꎬ 5H)ꎬ 2 90￣2 82 (mꎬ 2H)ꎬ 2 71 (dꎬ J = 12 7 Hzꎬ 1H)ꎬ 2 51 (ddꎬ J = 13 8ꎬ 7 6Hzꎬ 1H)ꎬ 2 35 (dꎬ J = 13 7 Hzꎬ 4H)ꎬ 2 24 (dtꎬ J = 24 8ꎬ 7 2 Hzꎬ 5H)ꎬ 1 92 (dꎬ J = 9 4 Hzꎬ 4H)ꎬ 1 90￣1 81 (mꎬ 2H)ꎬ 1 77￣1 53 (mꎬ 6H)ꎬ 1 41 (sꎬ 3H)ꎬ 1 33 (sꎬ 8H)ꎬ 1 29￣1 24 (mꎬ 4H)ꎬ 1 22 (sꎬ 3H)ꎬ1 16 (sꎬ 3H)ꎬ 1 12 ( dꎬ J = 6 5 Hzꎬ 4H). 13C NMR (126 MHzꎬ CDCl3 ) δ 142 6ꎬ 137 5ꎬ 133 5ꎬ 133 1ꎬ132 9ꎬ 130 9ꎬ 130 9ꎬ 130 1ꎬ 129 3ꎬ 128 6ꎬ 128 5ꎬ 127 8ꎬ 84 6ꎬ 81 0ꎬ 80 3ꎬ 79 0ꎬ 77 3ꎬ 76 3. 76 2ꎬ75 1ꎬ 74 4ꎬ 72 3ꎬ 72 1ꎬ 71 9ꎬ 61 8ꎬ 60 2ꎬ 58 3ꎬ 58 3ꎬ 55 6ꎬ 55 5ꎬ 46 1ꎬ 45 8ꎬ 43 2ꎬ 42 0ꎬ 40 4ꎬ38 6ꎬ 36 6ꎬ 36 4ꎬ 36 0ꎬ 35 6ꎬ 35 4ꎬ 33 1ꎬ 31 4ꎬ 31 1ꎬ 29 6ꎬ 28 1ꎬ 28 0ꎬ 26 7ꎬ 25 2ꎬ 23 5ꎬ 22 3ꎬ22 3ꎬ 20 5ꎬ 14 7ꎬ 9 5. 19F NMR (376 MHzꎬ CDCl3 ) δ￣83 12 ( dꎬ J = 33 9 Hzꎬ 1H)ꎬ￣84 77 ( dꎬ J = 34 4Hzꎬ 1H). HRMS (ESI) calcd for C65H84F2N6O19S3(M+H) + : 1387 4887 Found: 1387 4847ꎬ (Δ￣3 6 ppmꎬ￣4 9 mDa).
3 讨论
为了考察设计合成的紫杉烷-生物素共轭物是否能够靶向性的进入到肿瘤组织中ꎬ并在谷胱甘肽的作用下二硫链是否能够自动开链释放出细胞毒分子ꎬ合成了三个荧光标记的共轭物作为分子探针ꎬ利用流式细胞仪和荧光显微镜进行验证ꎮ 三个荧光标记共轭物分别是生物素-荧光标记物共轭物、香豆素衍生物-二硫键-生物素共轭物、荧光标记的紫杉烷分子-二硫键-生物素共轭物(见图 4)ꎮ 生物素-荧光标记物证明该共轭物能够通过生物素与肿瘤细胞膜上的相应受体结合ꎬ经过内吞作用进入到肿瘤细胞中ꎮ 香豆素衍生物-二硫键-生物素共轭物没有荧光性ꎬ在荧光显微镜下无法观测ꎬ只有该共轭物进入到肿瘤细胞内在谷胱甘肽的作用下ꎬ香豆素衍生物与二硫键发生断裂之后方能显现荧光性ꎬ实验观测到细胞中的荧光物质证明香豆素与二硫键能够顺利地在肿瘤细胞内断裂释放出显荧光性的香豆素衍生物ꎮ 荧光标记的紫杉烷分子-二硫链-生物素共轭物在前二者的验证基础之上进一步证实紫杉烷-生物素共轭物能够顺利地通过受体介导的内吞作用进入到肿瘤细胞中ꎬ并释放具有荧光标记的紫杉烷分子ꎬ其与微管蛋白结合ꎬ从而发挥抗肿瘤的作用ꎮ [10]
参考文献:
[1] SABBATINI Pꎬ BROWN J. A phase I/ II study of PG￣paclitaxel (CT￣2103) in patients with recurrent ovarianꎬ fallopian tubeꎬor peritoneal cancer[C] / / 38th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology. Orlandoꎬ Floridaꎬ American So￣ciety of Clinical Oncologyꎬ 2002.
[2] BRADLEY M Oꎬ WEBB N Lꎬ ANTHONY F Hꎬ et al. Tumor targeting by covalent conjugation of a natural fatty acid to pacli￣taxel [J]. Clin Cancer Resꎬ 2001ꎬ 7(10): 3229￣3238.
[3] GUILLEMARD Vꎬ SARAGOVI H U. Taxane￣antibody conjugates afford potent cytotoxicityꎬ enhanced solubilityꎬ and tumortarget selectivity[J]. Cancer Resꎬ 2001ꎬ 61(34): 694￣699.
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