[摘要]研究地道药材禹州漏芦主要活性成分总黄酮(FELT)对佐剂性关节炎(AA)大鼠Wnt信号的影响。采用大鼠关节炎评分法和MTT检测FELT对AA大鼠的治疗作用，Real-time qPCR检测FELT灌胃治疗对AA大鼠滑膜中Wnt信号关键基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表达的影响，Real-time qPCR检测FELT灌胃治疗对AA大鼠滑膜中Wnt信号上游负调控基因SFRP 1，2，4，5表达的影响。结果发现FELT对AA大鼠关节炎评分和MTT值有显著的抑制作用，对Wnt信号关键基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表达有显著的抑制作用，对SFRP 1，2，4表达有显著的上调作用。FELT灌胃治疗对AA大鼠有较好的治疗作用，这种治疗作用可能是通过对Wnt信号的抑制实现的。
[关键词]省级期刊论文发表,禹州漏芦总黄酮,佐剂性关节炎,Wnt,β-catenin
Flavonoids of Echinps latifolius suppress Wnt signaling in adjuvant arthritis rats
MIAO Cheng-gui1，2，3*， XU Jian1， GAO Hu1， LIU Liang-liang1， ZHOU Guo-liang1， QIN Mei-song1， CHEN Jian-zhong1， LI Cheng-feng1
(1. Food and Drug College， Anhui Science and Technology University， Bengbu 233100， China;
2.College of Pharmacy， Anhui Medical University， Heifei 230032， China;
3. Poultry Disease Monitoring Anhui Key Laboratory， Anhui Science and Technology University， Bengbu 233100， China)
[Abstract]The role of flavonoids of Echinps latifolius(FELT) in Wnt signaling was investigated in adjuvant arthritis (AA) rats. The therapeutic effects of FELT on AA rats were detected by rat arthritis score and MTT. The effect of FELT gavage treatment on the Wnt signaling key gene β-catenin， C-myc and cyclin D1 in synovium from AA rats was detected by Real-time qPCR， and the effects of FELT gavage treatment on the upstream negative regulation gene SFRP 1，2，4，5 in synovium from AA rats were detected by Real-time qPCR. The results showed that FELT gavage treatment significantly inhibited arthritis score and MTT values in AA rats， significantly inhibited the expression of the Wnt signaling gene β-catenin， C-myc and cyclin D1， significantly up-regulated the expression of the upstream negative regulation gene SFRP 1，2，4. FELT has a better therapeutic effect for AA rats.
[Key words]flavonoids of Echinps latifolius; adjuvant arthritis; Wnt; β-catenin
doi：10.4268/cjcmm20150125
类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种慢性、系统性、多关节性疾病，发病机制仍不清楚，世界范围内RA发病率为0.5%～1.0%，部分地区高达5%[1-2]。成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)在RA发病机制中发挥重要作用[3-4]。Wnt信号参与了RA的发病机制，与FLS异常活化增殖、持续的滑膜炎症、软骨侵蚀、骨的破坏等有关，Wnt通路相关分子可能是潜在的RA治疗靶点[5]。禹州漏芦为菊科华东蓝刺头Echinps latifolius Tausch的干燥根，主产于安徽、湖北、河南等省，其中以安徽、湖北的产量最大、质量最好。禹州漏芦具有抗炎、镇痛、耐缺氧、抗疲劳、降血压及降血脂等药理作用，是一种极具研究开发价值的中草药[6]。本文采用滁州产禹州漏芦为研究对照，分离提取其总黄酮，采用佐剂性关节炎大鼠为AA，大鼠关节炎评分法和MTT检测禹州漏芦总黄酮(FELT)对AA大鼠的治疗作用，Real-time qPCR检测FELT灌胃治疗对AA大鼠Wnt信号和对Wnt信号上游负调控基因SFRP 1，2，4，5表达的影响，为禹州漏芦的综合开发积累实验基础，为RA治疗提供新思路。 1材料
1.1仪器Applied Biosystems Gene Amp StepOneTM Real-time qPCR System(美国ABI公司);CO2培养箱(Thermo);超净工作台(江苏净化仪器设备有限公司);倒置荧光显微镜、倒置显微镜(奥林巴斯);ChemiScope3400 Mini化学发光成像(上海勤翔科学仪器有限公司);FA/JA型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);101AS-3型数显恒温干燥箱(上海浦东跃欣科学仪器厂)。
1.2药品与试剂禹州漏芦采集于安徽省滁州市凤阳县凤阳山地区，经安徽中医药大学王德群教授鉴定为菊科植物蓝刺头E. latifolius干燥根，正品。禹州漏芦总黄酮(FELT)由安徽科技学院药学系药物化学室研制。取安徽滁州产禹州漏芦干燥根，乙醇提取后减压浓缩，水溶液调pH至2.0，乙醚萃取后有机相精制浓缩，水相大孔树脂吸附，二者混合后浓缩为浸膏得FELT，以芦丁为对照品，HPLC检测FELT纯度为82.56%;QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen公司);逆转录试剂盒(Fermentas);β-catenin，C-myc，cyclin D1等定量PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。
2方法
2.1AA大鼠制备SD雄性大鼠，体重180～200 g，安徽医科大学实验动物中心提供(合格证号：皖医动准01号)，随机分为6组：正常组、AA组、FELT低、中、高剂量组(50，100，150 mg・kg-1)、布洛芬阳性对照组(8 mg・kg-1)，每组10只[7-8]。AA组及各给药组以福氏完全佐剂于每只大鼠右后足跖皮内注射0.1 mL致炎，正常对照组注射0.1 mL PBS。
2.2AA大鼠关节炎关节炎评分是基于对佐剂性关节炎大鼠不同部位的症状进行量化评价，具体评分标准如下。耳朵：0分，无结节和红肿;1分，1只耳朵出现结节和红肿;2分，2只耳朵都出现结节和红肿。鼻子：0分，无结节和红肿;1分，鼻子上出现结节和红肿。尾巴：0分，无结节和红肿;1分，尾巴出现结节和红肿。足爪：0分，足爪无结节和红肿;1分，1只足爪出现结节和红肿;2分，2只足爪出现结节和红肿;3分，3只足爪出现结节和红肿;4分，4只足爪出现结节和红肿。上述评分的加和即为每只佐剂性关节炎大鼠评分，最高评分为8分。
2.3大鼠滑膜FLS原代培养引颈处死大鼠，无菌条件下取滑膜组织，D-Hanks液反复漂洗组织块3次后剪成约1～2 mm3小块。37 ℃，5%CO2培养箱内培养2 h，使其贴壁。取出培养瓶加入预温的20%小牛血清DMEM培养液3 mL，再置37 ℃，5%CO2培养箱中继续培养。待滑膜FLS长出组织块较多后，弃除组织块，继续培养至细胞覆盖瓶底90%，0.5 g・L-1胰蛋白酶消化细胞传代培养。实验用细胞为传代3～5次细胞。
2.4MTT检测FLS增殖活性用含15%小牛血清的DMEM培养液混悬FLS，制备FLS悬液，浓度为1×105个/mL。将FLS悬液加至96孔培养板中，每孔100 μL，置于37 ℃，5%CO2条件培养24 h。FLS贴壁后换新的培养液100 μL，继续培养72 h后。每孔加MTT液10 μL，继续培养4 h，吸弃上清液，加入100 μL DMSO，酶标仪检测，结果以3个复孔的均值表示。
2.5Real-time qPCR检测FELT对AA大鼠滑膜β-catenin，C-myc和cyclin D1表达的影响分离对照大鼠和AA大鼠滑膜组织，采用Real-time qPCR检测FELT对AA大鼠滑膜Wnt信号通路关键基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表达的影响。引物序列见表1。
2.6Real-time qPCR检测FELT对AA大鼠滑膜SFRP 1，2，4，5表达的影响分离对照大鼠和AA大鼠滑膜组织，采用Real-time qPCR检测FELT对AA大鼠滑膜中Wnt信号上游负调控基因SFRP 1，2，4，5表达的影响。引物序列见表1。
2.7统计学分析数据分析采用SPSS 17.0软件，所有数据结果均以±s表示，组间比较采用One-Way ANOVA检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
3结果与分析
3.1对AA大鼠的治疗作用AA大鼠在造模后第12天继发性炎症明显，四肢出现红肿，关节炎评分显著增高。相较于AA组大鼠，FELT各治疗组大鼠关节炎评分显著降低，见图1。
3.2对AA大鼠FLS异常增殖的抑制作用与AA组大鼠相比，FELT各治疗组大鼠MTT值显著降低，见图2，提示FELT对AA大鼠FLS异常增殖有抑制作用。
3.3Real-time qPCR检测FELT对AA大鼠滑膜β-catenin，C-myc和cyclin D1表达的影响与AA组大鼠相比，FELT治疗组大鼠滑膜中经典Wnt信号通路关键基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表达均显著降低，见图3，表明FELT具有抑制AA大鼠滑膜β-catenin，C-myc和cyclin D1表达和抑制Wnt信号的作用。
3.4Real-time qPCR检测FELT对AA大鼠滑膜SFRP 1，2，4，5表达的影响与AA组大鼠相比，FELT治疗组大鼠滑膜中Wnt信号通路上游负调控基因SFRP 1，2，4表达均显著升高，见图4，表明FELT可能通过对Wnt上游负调控基因SFRP 1，2，4表达的上调抑制AA大鼠Wnt信号激活。 4讨论
按照信号通路的激活是否依靠β-catenin的活化，Wnt通路分为经典通路和非经典通路。大多数Wnt信号的研究都着眼于β-catenin介导的Wnt经典信号通路[9]。例如，在结肠癌中，转入细胞核中的β-catenin上调myc，cyclin D1基因表达，促进细胞的增殖癌变[10]。在非洲蟾蜍中，转入细胞核中的β-catenin上调纤维连接蛋白、细胞外基质蛋白表达，促进细胞的黏附和活化[11]。有证据表明ERK家族激酶能够被β-catenin经典信号激活，参与数种细胞分化过程。Wnt非经典信号通路包括Wnt/Ca2+信号通路和细胞极性通路。研究表明Wnt4和Wnt5a激活Wnt/Ca2+信号通路，此激活过程通过特定的G蛋白激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)，PI-PLC水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)生成二脂酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。细胞膜上的DAG在Ca2+和磷脂酰丝氨酸协助下激活蛋白激酶C(PKC)，PKC作用于细胞膜受体等相应靶蛋白，使之磷酸化影响信号传导。细胞极性通路前半部分与Wnt 经典通路完全相同， 不同之处在于Dvl由保守区域DIX，PDZ和DEP组成，DIX和PDZ介导经典Wnt 信号通路，DEP介导细胞极性通路的激活，例如Wnt7a与Fz受体结合激活细胞极性通路[12]。
Wnt信号调控细胞增殖分化、细胞癌变、肿瘤侵袭生长等，与肿瘤的发病机制密切相关，Wnt信号在调控RA发生发展过程中同样起重要作用[13-14]。与正常人滑膜组织相比，Wnt1，Wnt5a，Wnt5b，Wnt7b和Fz5在RA病人滑膜中显著高表达，Wnt1，Wnt5a和Fz5的高表达与RA炎症程度有关[15]。在RA病人关节FLS中同样检测到Wnt1，Wnt5a和Fz5高表达，进一步印证Wnt1，Wnt5a和Fz5与RA的密切相关[16]。SFRP作为Wnt的负调控蛋白分子在RA滑膜组织和FLS中都有表达，即RA特异的疾病内环境诱导了SFRPs的差异表达。SFRPs与炎症因子表达及RA发病机制可能有关[17]。
本文研究了FELT对AA大鼠的治疗作用及其信号通路，为滁州产禹州漏芦的综合利用开发积累实验基础，为RA防治提供新的思路。
[参考文献]
[1]Keen H I， Emery P. How should we manage early rheumatoid arthritis from imaging to intervention[J]. Curr Opin Rheumatol， 2005， 17(3)： 280.
[2]Huang Y J， Shiau A L， Chen S Y， et al. Multivalent structure of galectin-1-nanogold complex serves as potential therapeutics for rheumatoid arthritis by enhancing receptor clustering[J]. Eur Cell Mater， 2012， 13(23)： 170.
