[摘要]研究四逆汤中甘草与其他药味配伍后药效成分甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素含量的变化。以甘草单煎液、甘草附子合煎液、甘草干姜合煎液、四逆汤为供试品，采用HPLC测定甘草中4种药效成分的含量变化。结果显示甘草配伍不同药味之后4种药效成分含量均降低，且4种药效成分的含量均为甘草单煎液>甘草干姜合煎液>甘草附子合煎液>四逆汤。其中甘草苷质量浓度分别为11.18，9.89，9.67，9.17 mg・g-1;甘草酸质量浓度分别为20.76，15.58，11.30，8.52 mg・g-1;甘草素质量浓度分别为0.66，0.57，0.45，0.24 mg・g-1;异甘草素质量浓度分别为0.14，0.07，0.03，0.01 mg・g-1。因此，甘草配伍干姜后甘草中药效成分含量明显降低，为甘草可缓干姜之烈性提供了科学依据;甘草配伍附子后甘草中药效成分含量大幅度降低，为甘草解附子之毒的物质基础研究提供了科学支撑;甘草与附子、干姜共同配伍后甘草中药效成分含量进一步降低，说明四逆汤方中3味药相互依存相互牵制以共奏药效，体现了四逆汤药味之间相畏/相杀、相须/相使配伍的科学内涵。
[关键词]医学论文发表,四逆汤,甘草,配伍,含量变化
Changing rules study of effective components of Glycyrrhizae Radix et
Rhizoma before and after compatibilities in Sini decoction
PENG Wei1， JIANG Yan-ping1， FU Chao-mei1*， GAO Fei2， YANG Huan1， LIU Ge-yi1， YU Jia-li1
(1. Pharmacy College， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Ministry of Education Key Laboratory of
Standardization of Chinese Herbal Medicine， State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，
Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， China;
2. Hong Kong University， Li Ka-shing Medical College; Traditional Chinese Medicine College， Hong Kong 999077， China)
[Abstract]The change of the effective components (liquiritin， glycyrrhizic acid， liquiritigenin， isoliquiritigenin) contents of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GRR) before and after compatibilities in Sini decoction was studied in this paper. Taking single GRR decoction， GRR-Aconiti Lateralis Radix Praeparata (ALRP) decoction， GRR-Zingiberis Rhizoma (ZR) decoction and Sini decoction as test samples， the contents changing of the four effective components of GRR were measured by HPLC. The results showed that the contents of the four effective components of GRR in the single GRR decoction was higher than that in other samples， and the sequence was single GRR decoction>GRR-ZR decoction>GRR-ALRP decoction>Sini decoction. The contents of liquiritin were 11.18， 9.89， 9.67， 9.17 mg・g-1; the contents of glycyrrhizic acid were 20.76， 15.58， 11.30， 8.52 mg・g-1; the contents of liquiritigenin were 0.66， 0.57， 0.45， 0.24 mg・g-1; the contents of isoliquiritigenin were 0.14，0.07， 0.03， 0.01 mg・g-1. Therefore， the effective components of GRR decreased obviously after GRR compatibility with ZR providing scientific basis for GRR relieving the strong nature of ZR. The effective components of GRR decreased sharply after GRR compatibility with ALRP providing scientific support for the material foundation research of GRR reducing the toxicity of ALRP. The effective components of GRR decreased further in Sini decoction indicating that the three medicines in Sini decoction were interactional， which reflecting the scientific connotation of the mutual-restraint/mutual-detoxication， mutual-promotion/mutual-assistance compatibilities in Sini decoction. [Key words]Sini decoction; Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; compatibility; content changing
doi：10.4268/cjcmm20150116
四逆汤出自《伤寒论》，由附子、干姜、炙甘草组成，主治阳虚欲脱、冷汗自出、四肢厥逆、下利清谷、脉微欲绝，因其回阳温里祛寒之显效，被誉为回阳救逆第一方，现代临床常用于治疗冠心病心绞痛、心力衰竭、心肌梗等疾病[1-3]，具有良好的治疗效果。四逆汤药简力专，全方仅由3味药组成，然方中附子与甘草“相畏/相杀”配伍，附子与干姜“相须/相使”配伍，甘草与干姜“相须/相使”配伍，为中药七情配伍之典范，充分体现了中药配伍减毒增效的特点。目前，相关学者通过研究甘草减附子之毒以及干姜增附子之效2个环节，从化学成分、生物效应、体内过程[4-6]等多个层面阐释了四逆汤的配伍机制。课题组在前期研究中，通过对附子配伍甘草前后的汤液及汤液沉积物的化学组分、汤液相态、药理作用、胃肠吸收[7-11]等问题的探索，也在一定程度解释了四逆汤“毒减而效不减”的配伍机制。然而，目前对四逆汤的研究更多的是以附子作为焦点，对甘草、干姜在配伍前后的变化研究相对薄弱。为进一步揭示四逆汤的配伍机制，本研究以甘草作为关注对象，以药效成分甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素为指标，对比分析甘草在配伍前后的药效成分变化，为进一步研究奠定基础。
1材料
Shimadzu LC-20AT 型高效液相色谱仪(配SPD-M20AT 检测器， LC Solution 工作站，日本岛津公司)，METTLER AE240 电子分析天平(1/10万，梅特勒-托利多仪器有限公司)。
甘草苷(批号131217，纯度大于98%)、甘草酸铵(批号140227，纯度大于98%)、甘草素(批号131026，纯度大于98%)、异甘草素(批号130329，纯度大于98%)对照品均购自四川省维克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。白附片 Aconiti Lateralis Radix Praeparata(批号1403090)、干姜 Zingiberis Rhizoma(批号1403085)、炙甘草 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle(批号1401029)均购自四川省新荷花中药饮片有限公司，经成都中医药大学卢先明教授鉴定，均符合2010年版《中国药典》相关标准。
2方法
2.1色谱条件甘草苷、甘草酸：色谱柱为Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相0.05%磷酸水(A)-乙腈(B);梯度洗脱(0～8 min，81% A;8～11 min，81%～77% A;11～21 min，77%～76% A;21～44 min，76%～50% A;44～45 min，50%～0% A;45～50 min，0%～81% A);流速1.0 mL・min-1;进样量10 μL;柱温30 ℃;检测波长250，276 nm。甘草素、异甘草素：色谱柱为Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相0.5%冰醋酸(A)-乙腈(B);梯度洗脱(0～10 min，80%～55% A;10～20 min，55% A;20～30 min，55%～30% A;30～35 min，30% A;35～40 min，30%～80% A);流速1.0 mL・min-1;进样量10 μL;柱温30 ℃;检测波长276，370 nm。在上述色谱条件下，样品中甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素色谱峰的保留时间与对照品一致，成分色谱峰能达到较好的分离。对照品色谱图见图1，供试品色谱图见图2。
2.2对照品溶液的制备精密称取甘草苷、甘草素、异甘草素对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，分别制得每1 mL含甘草苷1.019 mg，甘草素0.335 mg，异甘草素0.139 mg的对照品溶液。精密称取甘草酸铵对照品适量，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制得每1 mL含甘草酸铵2.050 mg(折合甘草酸为2.008 mg)的对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备[12]甘草单煎样品：称取炙甘草饮片75 g，置圆底烧瓶中，加8倍量水浸泡0.5 h，回流提取，煮沸后小火保持微沸1.5 h，趁热滤过;提取3次，合并滤液，减压浓缩至适量，加水定容至100 mL。精密吸取2.5 mL，加水定容至25 mL，吸取5 mL，以12 000 r・min-1离心5 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
甘草附子合煎样品：称取白附片饮片75 g和炙甘草饮片75 g，其他操作同上，即得。
甘草干姜合煎样品：称取炙甘草饮片75 g和干姜饮片50 g，其他操作同上，即得。
四逆汤样品：称取白附片饮片75 g，干姜饮片50 g和炙甘草饮片75 g，其他操作同上，即得。
2.4线性关系考察将上述对照品溶液分别稀释，每个对照品溶液共6个浓度，得到一系列不同质量浓度的对照品溶液。取各个浓度的对照品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定峰面积。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得到回归方程与相关系数，见表1。 2.5精密度试验取同一份甘草单煎供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示，甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素峰面积的RSD分别为0.96%，2.9%，
2.5%，2.0%，表明仪器的精密度良好。
2.6稳定性试验取同一份甘草单煎供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，16，20，24 h进样，记录峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示，甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素峰面积的RSD分别为2.0%，0.63%，1.9%，1.5%，表明在24 h内供试品溶液的稳定性良好。
2.7重复性试验按2.3项下制法分别制备甘草单煎、甘草附子合煎、甘草干姜合煎、四逆汤供试品溶液，每个样品平行6份，按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示甘草单煎供试品中甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素峰面积的RSD分别为1.9%，1.1%，1.7%，2.8%;甘草附子合煎供试品中甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素峰面积的RSD分别为2.7%，0.54%，1.3%，1.3%;甘草干姜合煎供试品中甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素峰面积的RSD分别为1.8%，0.44%，0.95%，0.92%;四逆汤供试品中甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素峰面积的RSD分别为0.70%，1.3%，1.3%，2.3%。表明本方法重复性良好。
2.8加样回收率试验精密称取白附片饮片、炙甘草饮片和干姜饮片6份，按已知量(甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素质量浓度分别为9.17，8.52，0.24，0.01 mg・g-1)分别精密加入一定量的甘草苷、甘草酸铵、甘草素、异甘草素对照品溶液，按2.3项下制法制备四逆汤供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，结果显示甘草苷、甘草酸、甘草素、异甘草素的平均回收率分别为97.05%，100.3%，101.2%，101.5%，RSD分别为1.4%，1.7%，1.7%，2.0%。
2.9样品的含量测定取各药材饮片，按2.3项下制法制备供试品溶液，每个样品平行3份，并按2.1项下的色谱条件进行测定，计算各供试品中4种药效成分的含量及变化趋势，见表2，3。
3结果与分析
由表2可知，甘草中4种药效成分含量在配伍不同药味之后均降低且趋势相同，4种药效成分含量均为甘草单煎液>甘草干姜合煎液>甘草附子合煎液>四逆汤。其中甘草苷质量浓度分别为11.18，9.89，9.67，9.17 mg・g-1;甘草酸质量浓度分别为20.76，15.58，11.30，8.52 mg・g-1;甘草素质量浓度分别为0.66，0.57，0.45，0.24 mg・g-1;异甘草素质量浓度分别为0.14，0.07，0.03，0.01 mg・g-1。
由表2分析可知，与甘草单煎液相比，甘草附子合煎液中甘草药效成分含量下降，其作用机制可能为甘草中甘草酸、甘草素等酸性成分与附子中的乌头类生物碱成分发生复合，溶解度减小而析出沉淀[8]，进而也从甘草的角度印证了甘草可解附子之毒的科学性;与甘草单煎液相比，甘草干姜合煎液中甘草药效成分含量下降，藉此说明四逆汤中甘草与干姜亦存在相互作用，其作用机制推测为甘草中药效成分通过与干姜中的化学成分发生复合，沉淀析出而造成含量降低，其结果也与《成方便读・祛寒之剂》中“故以生附子之大辛大热，解散表里之寒邪，不留安纤芥，仍以干姜之守而协济之。用甘草者，一则恐姜附之烈，一则寓补正安中之意耳”的论述相契合，一定程度揭示了甘草可缓干姜烈性的科学内涵;与甘草单煎液、甘草附子合煎液、甘草干姜合煎液相比，四逆汤中甘草药效成分含量进一步下降，且除甘草素以外，其他3种甘草药效成分在四逆汤中的下降程度均小于甘草与附子、干姜单独配伍下降程度之和，表明四逆汤中药效成分的含量变化并非只是简单的线性叠加，而是一个相互影响相互克制的系统，相互作用以达到“毒减而效存”的配伍目的。同时，通过表3 还可发现，甘草中的4种药效成分含量在甘草附子合煎液中的下降程度均大于甘草干姜合煎液，其原因之一可能为甘草中的药效成分与附子中的生物碱成分发生了更为深度的复合作用，原因之二可能为2种合煎液中附子和干姜的用量不同而造成了差异(附子75 g，干姜50 g)，而其具体原因也有待进一步研究。
4讨论
四逆汤功善温中祛寒，回阳救逆，对心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、冠心病、心绞痛等心血管疾病的治疗具有良好效果[13]。传统观点认为，附子生物碱类成分即为四逆汤药理活性成分，现代研究表明甘草对心血管系统也具有较强的药理作用，作用机制与抗氧化、抗心律失常、抗缺血缺氧以及调血脂等有关，其主要活性成分为甘草皂苷类化合物和甘草黄酮类化合物。同时，2010年版《中国药典》将甘草苷、甘草酸规定为甘草饮片项下的含量测定指标成分，将甘草酸作为四逆汤的质量评价指标。因此，本研究从四逆汤的功效主治出发，结合甘草的质量要求以及相关药理作用，将甘草苷、甘草酸、甘草素和异甘草素作为指标成分。
在本论文的基础上，后期将研究甘草药效成分在不同配伍中的时间降解曲线，分析不同配伍对甘草药效成分的降解贡献，并联系四逆汤全方的降解曲线，探讨药对与全方之间是否存在叠加效应，进一步揭示四逆汤中甘草与其他药味配伍药效成分含量变化的规律;利用LC-MS等技术，定性与定量分析甘草不同样品中汤液沉积物的化学成分，研究甘草与附子、干姜之间的作用机制，完善四逆汤的物质基础研究;同时结合药效学方法继续探讨甘草单煎液、甘草附子合煎液、甘草干姜合煎液以及四逆汤的药效学差异，进一步揭示四逆汤配伍的科学内涵。 [参考文献]
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