[摘要] 目的 研究钙敏感受体(CaSR)和增殖细胞核抗原(PcnA)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其意义。方法 收集齐齐哈尔市第一医院胸外科2012～2013年手术标本，采用免疫组化法检测112例NSCLC组织及33例NSCLC癌旁组织中CaSR、PCNA的表达情况。 结果 CaSR和PCNA在NSCLC组织中的表达(86.36%、84.82%)明显高于癌旁组织(15.15%、24.24%)，差异均有统计学意义(P < 0.05)。CaSR与PCNA的表达水平与TNM分期、肿瘤大小、肿瘤分化及有无淋巴结转移有关(P < 0.05或P < 0.01)，与年龄、性别和肿瘤分型无关(P > 0.05)。在NSCLC组织中CaSR与PCNA的表达呈正相关(r = 0.401，P < 0.01)。 结论 CaSR和PCNA在NSCLC组织中的表达异常增高，并且具有较好的相关性，CaSR可能参与肺癌的增殖与分化，促进肺癌的发生发展。
[关键词] 临床医学论文,非小细胞肺癌,钙敏感受体,增殖细胞核抗原,免疫组织化学
Expression and clinicopathologic significance of calcium sensing receptor in non-small cell lung cancer
CUI Kailin1 WU Bingxia1 LI Bo1 WU Shuqin2 MIAO Hongzhi3 LI Guangwei1
1.Department of Pathophysiology， Qiaihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China; 2.Department of Physiology， Qiaihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar 161006， China; 3.Department of Thoracic Surgery， the First Hospital of Qiqihar， Heilongjiang Province， Qiqihar 161005， China
[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of calcium sensing receptor (CaSR) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The surgical samples in the Department of Thoracic Surgery， the First Hospital of Qiqihar from 2012 to 2013 were collected. The expression of CaSR and PCNA were detected in 112 paraffin-embedded NSCLC tissues and 33 adjacent normal lung tissues (control group) using immunohistochemistry. Results The expression levels of CaSR and PCNA (86.36%， 84.82%) were distinctly higher in NSCLC than those in the control group (15.15%， 24.24%)， the differences were statistically significant (P < 0.05). The expression of CaSR and PCNA in NSCLC were significantly correlated with tumor differentiation， TNM stage， tumor size and lymph node metastasis (P < 0.05 or P < 0.01) and not correlated with age， gender， tumor types (P > 0.05). The expression of CaSR was positive correlated with PCNA in NSCLC (r = 0.401， P < 0.01). Conclusion CaSR expression is correlated with PCNA expression， CaSR has an important function in NSCLC， and promotes the occurrence and development of NSCLC.
[Key words] Non-small cell lung cancer; CaSR; PCNA; Immunohistochemistry
近年肺癌已成为我国第一大癌症[1]，发病率和病死率逐年上升，因此肺癌的诊治已成为我国临床医生必须面临的严峻挑战。钙信号转导在肺癌发生中起重要作用，但其具体机制不甚清楚。钙敏感受体(calcium sensing receptor，CaSR)是新进发现的一种G蛋白偶联受体，由Brown等[2]于1993年首先从牛的甲状旁腺中克隆出来。国外多项研究证明，CaSR在肿瘤的发生中发挥着重要作用。细胞外钙离子可以通过CaSR促进乳腺细胞的增殖和分化，进一步导致乳腺癌的发生[3-4]。然而，肺癌组织中是否有CaSR蛋白的表达，其活化与肺癌发生及临床病理关系如何，迄今未见报道。本课题将对上述问题展开研究。
现报道如下：
1 材料与方法
1.1 材料
收集齐齐哈尔市第一医院(以下简称“我院”)胸外科2012～2013年非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)手术标本112例，包括对应的癌旁组织33例患者年龄32～76岁，平均(55.06±15.13)岁，男80例，女32例。33例癌旁组织患者的年龄35～72岁，平均(53.82±16.26)岁，男23例，女10例，其年龄、性别与NSCLC患者比较差异无统计学意义(P > 0.05)，具有可比性。112例NSCLC组织中，腺癌36例，鳞癌44例，腺鳞癌32例;按照国际抗癌联盟(UICC)2009年修订的TNM分期标准：Ⅰ期38例，Ⅱ期40例，Ⅲ期34例;有淋巴结转移62例，无淋巴结转移50例;高中分化74例，低分化38例。患者术前均未经化疗，所有标本均经过资深临床病理医生诊断，本研究经我院伦理委员会同意，取得患者或家属的同意并签署知情同意书。
1.2 主要试剂
兔抗CaSR多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，鼠抗增殖细胞核抗原(PCNA)多克隆抗体购自于武汉博士德生物技术有限公司，免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 实验方法
组织标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，厚度约4 μm。采用免疫组织化学SP二步法。切片经3%过氧化氢去离子水孵育5 min，以阻断内源性过氧化物酶;磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗;滴加一抗，37℃孵育1 h，PBS冲洗;滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育15 min，PBS冲洗;应用二氨基联苯胺溶液显色，显微镜下控制，去离子水冲洗多余未结合的显色液;水洗、苏木精复染、1%盐酸酒精分化;返蓝，脱水，透明封片。显微镜下观察结果。
1.4 结果判读标准
CaSR表达主要在胞浆及胞膜，呈棕黄色颗粒。PCNA表达主要在胞核，为棕黄色颗粒。400倍视野下，每例随机选取不重复5个视野，每个视野计数100个细胞。然后按阳性细胞占全部细胞的百分率分为：无着色为(-)，阳性细胞数≤25%为(+)，>25%～75%为(++)，>75%为(+++);(-)～(+)定义为低表达，(++)～(+++)定义为高表达[5]。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，采用Spearman等级相关性检验进行相关性分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 钙敏感受体和增殖细胞核抗原在非小细胞肺癌及癌旁组织中的表达
CaSR表达主要在胞浆及胞膜，其在NSCLC和癌旁组织中的阳性表达率分别为86.36%(97/112)、15.15%(5/33)。PCNA表达在胞核，阳性表达率分别为84.82%(95/112)、24.24%(8/33)。二者在NSCLC组织中的表达显著高于癌旁组织(P < 0.05)，且在癌旁组织中的阳性表达均为低表达。见图1、2(封四)。
2.2 钙敏感受体和增殖细胞核抗原表达与临床病理特征的关系
NSCLC组织中CaSR蛋白的阳性表达率与性别、年龄及病理类型均无相关性(P > 0.05)，但是CaSR蛋白与PCNA的阳性表达率与肿瘤大小、TNM分期、肿瘤分化、淋巴结转移密切相关，组间比较差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。见表1。
2.3 钙敏感受体和增殖细胞核抗原在非小细胞肺癌中表达的相关性
经Spearman等级相关性分析结果显示，NSCLC组织中CaSR和PCNA的表达且呈正相关(r = 0.401，P < 0.01)。见表2。
3 讨论
恶性肿瘤是人类健康的第一杀手，肺癌在恶性肿瘤中所占位次由原来的第4位上升至第1位[1]。据世界卫生组织预测，到2015年我国将成为世界第一肺癌大国，因此肺癌的诊治已成为我国临床医生必须面临的严峻挑战。细胞内钙离子是重要的第二信使，能够激活不同的信号通路，参与许多重要生命活动的调节[6]。肿瘤发生发展过程常伴随钙离子信号的异常，但其发生机制不甚清楚。因此，了解肺癌发生、发展的分子机制，可以显著改善患者预后，提高患者生存质量，为肺癌治疗寻找新靶点提供依据。
CaSR是G蛋白偶联受体C家族的成员，其功能主要是维持Ca2+和其他金属离子稳态，同时在细胞分泌、增殖、分化、趋化、凋亡、基因表达、维持膜电位、离子通道开关、衰老等过程中亦发挥重要作用[7-11]。越来越多的研究表明，在肿瘤的发生发展过程中CaSR发挥着重要作用[12-14]。CaSR是影响乳腺癌预后的独立的风险因子[15]。CaSR基因敲除，则导致体外细胞增殖和体内骨转移的进程减慢[16]。然而，在肺癌组织中是否有CaSR蛋白的表达，以及CaSR与肺癌的发生发展之间是否有关，目前国内外未见报道。本实验通过免疫组织化学技术观察了CaSR在NSCLC组织中的表达。结果显示，CaSR在癌旁组织中呈阴性或低表达，而在大部分NSCLC组织中表达显著上调，其表达强度随肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤大小及淋巴结转移情况而不同，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。上述结果提示，NSCLC中CaSR的表达可能与肿瘤细胞的增殖及侵袭、转移有关。
Osvaldo等[17]研究证实活化的CaSR可以抑制正常结肠上皮细胞和结肠癌早期上皮细胞的增殖。同时，在其他实验中观察到CaSR活化能够促进肺动脉平滑肌细胞增殖[18-19]，因此，本研究推测CaSR活化促进肺癌细胞增殖。为了观察NSCLC中CaSR活化与肺癌细胞增殖的关系，本实验还检测了PCNA蛋白在NSCLC中的表达。PCNA是公认的细胞增殖的标志物。其表达增加，代表着细胞增殖活跃。本研究观察到：在癌旁组织中PCNA呈阴性或低表达，在大部分NSCLC组织中表达显著增高，其表达强度随肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤大小及淋巴结转移情况而不同，差异有统计学意义(P < 0.05)。Spearman等级相关性分析显示：NSCLC组织中CaSR和PCNA的表达呈正相关(r = 0.401，P < 0.01)。进一步验证了笔者的假设即CaSR活化促进肺癌细胞增殖。 本实验只在临床肺癌标本中初步观察到此现象，关于CaSR活化后通过什么信号途径和机制引起肺癌细胞增殖，及其与肺癌患者预后有什么关系，在肺癌患者的临床治疗中有何作用，有待于深入的研究。
[参考文献]
[1] Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al. Global cancer statistics [J]. 2002，CA Cancer J Clin，2005，55(2)：74-108.
[2] Brown EM，Gamba G，Riccasrdi D，et al. Cloning and characterization of an extracellular Ca2+-sensing receptor from bovine parathyroid [J]. Nature，1993，366(6455)：575-580.
[3] EL Hiani Y，Ahidouch A， Lehen，kyi V，et al. Extracellular signal-regulated Kinases 1 and 2 and TRPC1 channels are required for calcium-sensing receptor-stimulated MCF-7 breast cancer cell proliferation [J]. Cell Physiol Biochem，2009，23(4-6)：335-346.
[4] Huang C，Hydo LM，Liu S，et al. Activation of choline kinase by extracellular Ca2+ is Ca2+-sensing receptor， Gα12 and Rho-dependent in breast cancer cells [J]. Cellular Signalling，2009，21(12)：1894-1900.
[5] 韩文恒，张逊，徐美林，等.Cdc42和WAVE1在非小细胞肺癌中的表达及临床病理意义[J].中国肿瘤临床，2013， 23(40)：1445-1449.
[6] 张奇，何建行，卢文菊，等.经典瞬时受体电位通道蛋白在人非小细胞肺癌组织中的表达[J].中国肺癌杂志，2010， 13(6)：612-616.
