硒是哺乳动物必需的一种微量元素，缺硒会导致多种病理状态. 硒蛋白是微量元素硒发挥生物学功能的主要形式. 为了进一步探讨硒蛋白P在肿瘤中的作用，我们利用免疫组化技术观察该抗体在结肠癌中的表达。
《癌症》杂志是由中华人民共和国教育部主管，中山医科大学肿瘤防治中心(世界卫生组织癌症研究合作中心)主办，美国LANDES出版社协办的核心科技期刊。创刊于1982年2月，月刊，大16开，112页，进口铜版纸彩印，国内外公开发行。
1对象和方法
1.1对象结肠癌30例，为第四军医大学唐都医院普通外科200310/200505手术切除标本,男17例，女13例. 年龄45~79(平均61.4)岁;高分化10例，中分化5例，低分化15例;肿瘤TNM分期：I期8例，II期9例，III期13例. 另取30例原发器官正常结肠组织作为对照.
兔抗人硒蛋白P多克隆抗体，由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室先期制备保存. 免疫组化试剂盒购自北京中杉公司.
1.2方法① 将组织蜡块切片，常规脱腊：70℃烤片2 h，二甲苯10 min×2次. 水化： PBS洗3 min×2次. ② 30 mL/L H2O2溶液室温处理10 min，双蒸馏水洗3 min×3次. ③ 在0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)92~98℃水浴中处理25 min修复抗原，自然冷却到室温. 缓冲液洗3min×2次. ④ 分别用正常山羊血清和卵白素室温封闭2 h. ⑤ 滴加稀释的一抗SelP多克隆抗体(1∶50)，37℃孵育4 h. PBS洗3 min ×3次. ⑥ 生物素结合的羊抗兔IgG二抗和ABC复合物室温分别孵育2 h. ⑦ 滴加DAB溶液显色，注意观察颜色变化，及时终止，冲洗. ⑧ 苏木素复染，梯度乙醇脱水，封片.
以免疫组化试剂盒中的阳性片作阳性对照，以0.01 mol/L PBS(pH 7.4)和正常羊血清分别替代一抗和二抗作为阴性对照. 阳性染色为棕黄色，定位于细胞胞质和细胞膜. 染色阳性细胞数量评分： 0分(全片未见着色或少于5%细胞散在着色)，1分(5%~25%细胞着色)，2分(25%~50%细胞呈阳性)，3分(50%~75%细胞染色阳性)，4分(>75%细胞染色阳性). 染色强度评分：0分(阴性)，1分(弱阳性)，2分(中等阳性)，3分(强阳性). 染色阳性细胞数量评分与染色强度评分之积为最终染色评分标准：0分(阴性)，0~4分(弱表达)，4~8分(中等表达)，8~12分(强表达).
统计学处理: 采用SPSS10.0统计软件包，用非参数检验，两个独立样本Wilcoxon检验进行统计学分析. P<0.05认为存在显著性差异.
2结果
2.1硒蛋白P在肿瘤及正常对照组织中的表达免疫组化染色结果见表1.表1硒蛋白P在肿瘤及正常对照组织中的表达 阳性信号为棕褐色或棕黄色，呈弥漫状或片状分布. 硒蛋白P染色主要定位于细胞胞质及胞膜中，细胞外间质也有部分染色，而细胞核无染色.在结肠癌中硒蛋白P表达与分化程度有关，尤其是伴黏液分泌者中低表达明显;细胞富于黏液成分或杯状细胞无论是正常还是肿瘤中表达均为阴性.硒蛋白P在正常对照组织中的阳性率表达高于结肠癌中的表达(图1).
2.2硒蛋白P在肿瘤中的表达与其分化程度及临床分期的关系见表2.
3讨论
目前硒蛋白P真正的生物学功能还不清楚，特别是与肿瘤发生的关系不甚明了. Burk等[1]认为硒蛋白P可能是自由基的清除剂. 硒蛋白P可能由于其抗氧化的保护性作用，通过消除自由基，减少DNA损伤，预防突变阻止肿瘤的发生[2-3]. 其他可能的机制是调节机体免疫系统，增强机体免疫系统的抗癌活力;拮抗肿瘤细胞内cGMP的增加，抑制DNA, RNA及蛋白质的合成;抑制肿瘤病变中新生血管生成[4-6].
A: 结肠癌组织; B: 正常结肠组织.
图1硒蛋白P的表达ABC ×200 表2硒蛋白P在结肠癌组织中的表达与临床病理学因素的关系现认为血浆中硒蛋白P水平和肿瘤的发生呈负相关，PerssonMoschos等[7]发现对应于硒蛋白P浓度的5个水平，从低到高，发生肿瘤的相对危险度分别为5.2, 2.3, 2.9, 2.2和1.0，硒蛋白P水平最低组发生呼吸道和消化道肿瘤的概率分别是硒蛋白P高水平组的6倍和3.4倍，表明随着硒蛋白P浓度增高，肿瘤发生的危险度降低.
Mork等[2]发现，结直肠腺瘤较邻近正常黏膜硒蛋白P mRNA表达下降，并认为在结直肠腺瘤硒蛋白P mRNA表达下调可能是腺瘤到腺癌发展过程中的一个早期事件，这种下调使硒蛋白P表达减少，导致DNA受到氧化损伤，从而发生基因突变，引起肿瘤的发生和促进肿瘤的发展，而且硒蛋白P和同属硒蛋白的胃肠谷胱甘肽过氧化物酶在抗氧化细胞抵抗腺瘤腺癌演变中起到互补作用. AlTaie等[3]证实在结直肠癌中其mRNA表达明显减少或缺失，表明在结肠癌中可能存在着硒蛋白P基因的突变和转录异常.
本结果提示，硒蛋白P表达在结肠癌与正常组织差异显著，表达与分化程度有关. 伴黏液分泌者中低表达，细胞富于黏液成分或杯状细胞无论是正常还是肿瘤中表达均为阴性. 或许提示正常肠黏膜杯状细胞分泌功能与硒蛋白P表达无关;同样，其在结肠癌中的表达与肿瘤分期无关. 在结肠癌硒蛋白P低表达，除了受硒营养状况(血浆中硒蛋白P浓度)的影响，可能存在着硒蛋白P基因的突变和转录异常[3]，失去这一保护性因素，可能导致了肿瘤的发生.
【参考文献】
[1] Burk RF,Hill KE. Regulation of selenoproteins [J]. Annu Rev Nutr, 1993,13:65-81.
[2] Mork H, AlTaie OH, Bahr K, et al. Inverse mRNA expression of the selenocysteinecontaining proteins GIGPx and SeP in colorectal adenomas compared with adjacent normal mucosa[J]. Nutr Cancer, 2000,37(1):108-116.
[3] AlTaie OH, Uceyler N, Eubner U, et al. Expression profiling and genetic alterations of the selenoproteins GIGPx and SePP in colorectal carcinogenesis[J]. Nutr Cancer, 2004,48(1):6-14.
[4] Ganther HE. Selenium metabolism and mechanisms of cancer prevention[J]. Adv Exp Med Biol, 2001,492:119-130.
[5] Raich PC, Lu J, Thompson HJ, et al. Selenium in Cancer Prevention:Clinical Issues and Implications[J]. Cancer Invest, 2001,19(5):540-553.
[6] Brown KM,Arthur JR.Selenium,selenoproteins and human health:a review[J]. Public Health Nutr, 2001,4(2B):593-599.
[7] PerssonMoschos ME, Stavenow L, Akesson B, et al. Selenoprotein P in plasma in relation to cancer morbidity in middleaged Swedish men[J]. Nutr Cancer, 2000,36(1):19-26
