[摘要] 目的 研究Survivin在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生和子宫内膜样腺癌(EA)三种组织中表达的差异。 方法 选取华北石油管理局总医院2010年1月～2012年6月手术切除子宫并经病理证实的EA存档标本40例(EA组)，经诊刮或宫腔镜检查病理结果示子宫内膜不典型增生20例(AHE组)，同时选取同期因子宫脱垂或子宫肌瘤行子宫切除的正常子宫内膜20例作为对照(CON组)。通过免疫组织化学法检测三组中Survivin表达情况的差异。应用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。 结果 EA组的Survivin表达阳性率为90%，显著高于CON组(75%)，差异有统计学意义(P < 0.05)。在EA组中，组织分级为G1、G2、G3级的患者Survivin阳性率分别为85.0%、90.9%、100.0%，差异有统计学意义(P < 0.05);手术-病理分期为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期的患者Survivin阳性率分别为62.1%、85.7%、100.0%，差异有统计学意义(P < 0.05);肌层浸润深度<1/2及≥1/2的患者Survivin阳性率分别为88.5%、92.9%，差异无统计学意义(P > 0.05);存在淋巴结转移及无淋巴结转移的患者Survivin阳性率为100.0%、80.6%，差异无统计学意义(P > 0.05);存在脉管浸润及无脉管浸润的患者Survivin阳性率分别为100.0%、84.2%，差异无统计学意义(P > 0.05)。 结论 相较于正常子宫内膜，EA组织中Survivin表达显著增多。Survivin的阳性表达率与EA组织学分级和手术-病理分期相关，与肌层浸润、淋巴结转移及有无脉管浸润无关。
[关键词] 基础医学论文发表,子宫内膜样腺癌,Survivin,免疫组织化学,组织分级,手术-病理分期
Expression of Survivin in endometrial carcinoma
WANG Lili1 ZHU Zhenlong2▲ HAO Tong3
1.Department of Obstetrics and Gynecology， North-China Petroleum Administration Bureau General Hospital， Hebei Province， Renqiu 062552， China; 2.Department of Pathology， the First Hospital， Hebei Medical University， Hebei Province， Shijiazhuang 050030， China; 3.Department of Pathology， North-China Petroleum Administration Bureau General Hospital， Hebei Province， Renqiu 062552， China
[Abstract] Objective To compare the expression of Survivin in normal endometrium， atypical hyperplasia of endometrium and endometrioid adenocarcinoma. Methods Forty cases of endometrioid adenocarcinoma samples resected from operation and confirmed by pathology were selected as EA group， 20 cases of atypical hyperplasia of endometrium (AHE) confirmed by pathologic from endocervical curettage or hysteroscopy were selected as AHE group， 20 cases of normal endometrium from hysterectomy for uterine prolapse or uterine fibroids were selected as control group (CON group) in North-China Petroleum Administration Bureau General Hospital from January 2010 to June 2012. Expression of Survivin in the three groups were detected by immunohistochemistry method. All the data was analyzed by SPSS 16.0. Results The positive expression rate of Survivin in the EA group was 90%， which was higher than that in the CON group (75%)， with statistically significant difference (P < 0.05). In EA group， the positive expression rates of Survivin in patients with organization classification of G1， G2， G3 were 85.0%， 90.9% and 100.0%， with statistically significant differences (P < 0.05); which in panties with surgery-pathological staging of Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ were 62.1%， 85.7% and 100.0%， with statistically significant difference (P < 0.05); which in patients with muscularis invasion depth<1/2 or ≥1/2 were 88.5% and 92.9%， without statistically significant difference (P > 0.05); which in patients with lymphatic metastasis or non- metastasis were 100.0% and 80.6%， without statistically significant difference (P > 0.05); which in patients with vascular invasion or non-vscular invasion were 100.0% and 84.2%， without statistically significant difference (P > 0.05). Conclusion Compared with normal endometrium， endometrioid adenocarcinoma has higher Survivin expression. The positive expression rates of Survivin are correlated with the histological grade and surgery-pathological stage of EA， but has no relationship with myometrial invasion， lymph node metastasis or vascular invasion. [Key words] Endometrial carcinoma; Survivin; Immunohistochemistry; Histological grade; Surgery-pathological stage
子宫内膜样腺癌(endometrioid adenocarcinoma，EA)是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一。在我国，EA的发病率高居妇科恶性肿瘤的第2位[1]。迄今为止，有关EA的发病机制尚存在争论。Survivin基因是凋亡抑制(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)基因家族的新成员，具有调节细胞有丝分裂和抑制细胞凋亡的双重作用[2]。在众多肿瘤和胚胎组织中都有表达，但在成熟分化细胞中完全缺失。目前针对Survivin在EA中的研究正逐步开展，已发现Survivin具有作为子宫内膜癌诊断标志物的潜力，有学者应用免疫组织化学(streptavidin-peroxidase，SP)法、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western-blot等方法对比了正常子宫内膜组织、不典型增生内膜组织和子宫内膜癌组织中Survivin水平后，认为在癌组织中，Survivin水平明显高于正常组织和不典型增生组织，并且有可能成为治疗子宫内膜癌的靶点[3-4]。本研究应用SP法检测正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生(atypical hyperplasia of endometrium，AHE)及EA中Survivin的表达，旨在探讨其在EA发生、发展中的作用，为临床诊断、治疗EA提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
选取华北石油管理局总医院2010年1月～2012年6月手术切除子宫并经病理证实的EA存档标本40例作为EA组，年龄31～77岁，平均53.4岁。选取经诊刮或宫腔镜检查病理结果示AHE样本20例(AHE组)。同时选取同期因子宫脱垂或子宫肌瘤行子宫切除的正常子宫内膜样本20例作为对照组(CON组)。依据2009年修订的国际妇产科联盟(FIGO)EA的手术-病理分期标准进行分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期7例，Ⅲ期4例;组织分级[G1(高分化)：非鳞状或桑葚状实性生长类型为≤5%;G2(中分化)：非鳞状或桑葚状实性生长类型为>5%～50%;G3(低分化)：非鳞状或桑葚状实性生长类型为>50%]显示，G1 20例，G2 11例，G3 9例;子宫内膜浸润深度<1/2 26例，子宫内膜浸润深度≥1/2 14例;淋巴结无转移36例，有转移4例;淋巴脉管无浸润38例，浸润2例。所选标本临床病历资料完整，术前均未行化疗、放疗或免疫治疗等，同时排除合并有其他部位恶性肿瘤。所有标本诊断均经2名高年资病理医师再次审核确认。所选标本蜡块均做4 μm连续切片6张，其中3张分别行常规HE染色和SP染色，其余3张备用。
1.2 方法
1.2.1 免疫组化染色 采用SP法，严格按照SP试剂盒的说明书进行操作，用已知的阳性切片作为阳性对照，同时以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。具体步骤如下：将切片浸于二甲苯中5 min 2次，100%、95%、90%、85%、75%乙醇中各5 min 2次，自来水冲洗，PBS洗2次。1%甲醇双氧水，室温10 min，蒸馏水冲洗3次，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。抗原微波热修复将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92～98℃并持续15 min。取出容器，室温冷却15 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。用以防止抗原与非特异性抗体结合，甩去多余液体，不洗。切片上滴加第一抗体(兔抗人Survivin多克隆抗体的原液浓度为1 mg/mL，稀释度为1∶10，北京博奥森生物技术有限公司)，4℃过夜，0.1 mol/L PBS洗3次× 5 min。切片上滴加生物素化的山羊抗兔第二抗体(稀释度为1∶100，北京博奥森生物技术有限公司)，室温下30 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温下30 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。使用DAB显色试剂盒，1 mL蒸馏水按顺序滴加显色剂A、B、C各1滴，镜下控制显色时间。充分水洗。水洗后，苏木精复染细胞核3 min，依次放入蒸馏水，70%、80%、90%、100%乙醇各20 min，二甲苯1 h时脱水，中性树脂封片。最后选择各组阳性和阴性组织相进行100×和200×显微照相。
1.2.2 HE染色 切片常规脱蜡至水，苏木精染色3 min，自来水冲洗;1%盐酸乙醇分化3 s，自来水冲洗;氨水乙醇返蓝5 s，自来水冲洗;伊红染色5 s，自来水冲洗;梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂胶封片。
1.2.3 免疫组织化学染色结果判定 胞核中棕黄色颗粒染色深、均匀一致为阳性，胞核中未见棕黄色颗粒为阴性。实验过程中选择乳腺癌标本做阳性对照。每例随机选出10个不重复、不重叠的高倍镜视野，计数阳性细胞数及所有细胞数，计算阳性细胞率=Σ阳性细胞数/Σ总细胞数×100%。染色强度：基本不着色为0分，浅黄色为1分，橘黄色为2分，棕黄色为3分;着色细胞占计数细胞百分率：≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%为3分。将每张切片染色程度与染色细胞百分率得分相加之和为其最后得分。标本染色得分在0～6分之间，其中，0～2分为阴性，≥3分为阳性。
1.3 统计学方法
采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 各组Survivin表达情况
在正常子宫内膜组织Survivin不表达或仅有少部分腺体表达，且呈弱阳性(图1A)，而Survivin在EA和AHE中的表达呈强阳性(图1B、C)。统计结果显示：EA组的Survivin表达阳性率为90%(36/40)，AHE组的Survivin表达阳性率为75%(15/20)，CON组的Survivin表达阳性率仅为20%(4/20);其中，EA组及AHE组中Survivin表达阳性率显著高于CON组，差异有统计学意义(P < 0.05)，EA组的Survivin表达阳性率较AHE组有增高趋势，但差异无统计学意义(P > 0.05)。
A：CON组(弱阳性);B：AHE组(强阳性);C：EA组(强阳性)
图1 各组子宫内膜组织Survivin表达情况(SP法，100×)
2.2 EA组临床病理参数与Survivin表达的关系
2.2.1 EA组织分级与Survivin表达的关系 在EA组中，组织分级为G1级的患者Survivin阳性率为85.0%(17/20)，G2级Survivin阳性率为90.9%(10/11)，G3级Survivin阳性率为100.0%(9/9)。统计学比较显示，不同组织分级患者Survivin表达差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.2.2 EA组手术-病理分期与Survivin表达的关系 在EA组中，手术-病理分期为Ⅰ期的患者Survivin阳性率为62.1%(18/29)，Ⅱ期Survivin阳性率为85.7%(6/7)，Ⅲ期Survivin阳性率为100.0%(4/4)。统计学比较显示，不同手术-病理分期分级患者Survivin表达差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.2.3 EA的肌层浸润深度与Survivin表达的关系 在EA组中，肌层浸润深度<1/2的患者Survivin阳性率为88.5%(23/26)，肌层浸润深度≥1/2的患者Survivin阳性率为92.9%(13/14)。统计学比较显示，不同肌层浸润深度患者Survivin的阳性表达率差异无统计学意义(P > 0.05)。
2.2.4 EA的淋巴结转移与Survivin表达的关系 在EA组中，存在淋巴结转移的患者Survivin阳性率为100.0%(4/4)，无淋巴结转移患者Survivin阳性率为80.6%(29/36)。统计学比较显示，不同淋巴结转移患者Survivin的阳性表达率差异无统计学意义(P > 0.05)。
2.2.5 EA的脉管浸润与Survivin表达的关系 在EA组中，存在脉管浸润的患者Survivin阳性率为100.0%(2/2)，无脉管浸润的患者Survivin阳性率为84.2%(32/38)。统计学比较显示，不同脉管浸润患者Survivin的阳性表达率差异无统计学意义(P > 0.05)。
3 讨论
1997年，Ambrosini等[2]率先在人类基因组库中通过筛选、分离等手段，最终克隆出Survivin。Survivin基因是一种新型凋亡抑制基因，其定位于17号染色体的q25区，编码产生Survivin蛋白。Survivin蛋白是抗凋亡作用最强但分子量最小的凋亡抑制蛋白(IAP)，它在恶性肿瘤组织及胚胎中表达丰富，在子宫内膜、胸腺、胎盘等组织也可有少量表达，但其在正常的分化成熟组织以及癌旁组织中则为低表达或无表达。Survivin基因的特异性表达的特点使其在肿瘤研究领域日益受到重视。
先后有报道证实，Survivin基因在肝癌、胆囊癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌、鼻癌及神经胶质瘤等肿瘤组织中高表达，并与肿瘤的治疗及预后相关[5-13]。Takai等[4]研究发现，Survivin基因在正常子宫内膜组织中的表达极低，但在EA组织中表达的阳性率却极高。本研究结果也显示了相似的结果，即EA组和AHE组中Survivin的表达率分别为90%(36/40)和75%(15/20)，均明显高于正常子宫内膜组[20%(4/20)，P < 0.05]，提示Survivin基因在EA的发生中起着重要作用。
有学者发现Survivin基因表达的强度与肿瘤的组织分级、临床分期及组织浸润深度等呈正相关，Survivin基因表达增高往往预示治疗困难及预后较差[9-10， 12]。Stefansson等[14]研究认为，Survivin基因表达的强度与EA的组织分级、临床分期及肌层浸润深度呈正相关，且Survivin蛋白与EA恶性程度及临床预后密切相关，其高表达提示EA患者的低生存率[4，14]。但对此一些学者则持相反观点，认为Survivin基因表达的强度与EA的组织分级、临床分期及生存率不存在相关性[15-16]。本研究发现，Survivin的表达强度与EA组织学分级和手术-病理分期存在一定相关性，与肌层浸润、淋巴结转移及有无脉管浸润无关。手术-病理分期Ⅲ期患者EA表达率明显高于Ⅰ期患者，说明肿瘤组织分化越差，分期越严重，组织中Survivin蛋白的表达水平就越高。因此，笔者推断Survivin蛋白在肿瘤形成的各个阶段都起了至关重要的作用，与Takai等[4]的报道相符。Eekanli等[15]研究表明，Survivin蛋白表达超过正常值即可以判定组织存在癌变可能，提示Survivin蛋白具有筛查诊断早期肿瘤的价值，是EA形成过程中的早期事件。本研究中20例正常子宫内膜中有4例表达呈阳性，这可能与子宫内膜细胞增殖活跃有关，提示应对该类患者进行密切随访。
综上所述，Survivin蛋白可能通过抑制细胞凋亡程序，并能维持或促进基因缺陷的细胞生存优势，进而导致基因的突变和细胞的转化，因此，Survivin在EA的发生、发展中发挥重要作用。 [参考文献]
[1] Kellert IM，Botterweck AA，Huveneers JA，et al. Trends in incidence of and mortality from uterine and ovarian cancer in Mid and South Limburg，The Netherlands，1986-2003 [J]. Eur J Cancer Prev，2009，18(1)：85-89.
[2] Ambrosini G，Adida C，Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene， survivin， expressed in cancer and lymphoma [J]. Nat Med，1997，3(8)：917-921.
