菘蓝是一种草本植物，具有较高的药用价值和经济价值，本文首先介绍了菘蓝的特性，随后探讨了菘蓝的几种栽培技术。
《土壤与作物》(季刊)创刊于2012年3月，黑龙江省科学院主管，中国科学院东北地理与农业生态研究所主办，是我国又一个有关土壤学、农业生态学及其相关基础学科的综合性学术期刊。将认真贯彻“双百”方针，面向国际科技前沿和国家需求，旨在介绍土壤与作物系统研究的最新成果。
菘蓝(Isatis indigotica Fort.)为十字花科( Cruciferae)菘蓝属(Isatis)二年生草本植物，其根(板蓝根)和叶(大青叶)均可入药，是2010版《中国药典(一部)》收录的常用中药品种，原产我国，全国各地均有栽培。菘蓝具有清热解毒、凉血消斑、利咽止痛之功效，含有靛蓝、靛玉红、有机酸、多糖等多种有效成分，广泛用于治疗流感、腮腺炎、乙脑、肝炎等多种疾病，其多糖组分具有一定的免疫调节和降血脂作用，而靛玉红对治疗慢性粒细胞白血病有较好的作用(刘海利，2002)。
单倍体育种过程中，植株经染色体加倍后，在一个世代中即可出现纯合二倍体，其性状不分离，表型整齐一致，育种年限显著缩短。由于没有显性基因的掩盖，隐性基因控制的性状容易显现，这对诱变育种和遗传突变研究具有较大的优势。我国应用单倍体育种技术先后育成了烟草、水稻、小麦等多个优良品种。目前，关于菘蓝组织培养及植株再生体系建立的文献较多(涂玉琴等，2009;张菊红等，2006;张胜珍等，2009;汪洪等，2008)，但有关菘蓝花药培养及单倍体诱导的研究尚未见报道。本实验以菘蓝花药为试材，研究花药培养及植株再生的适宜条件，以期为菘蓝单倍体育种提供一定的研究基础。
1 材料与方法
1.1材料
2009年4-5月间，随机抽取种植于本校试验田二年生的菘蓝花药为实验材料。
1.2方法
1.2.1小孢子发育时期的检测取材当日7：00-10: 00摘取生长健壮、无病虫害、直径不同、闭合的菘蓝花蕾，同时观察记录花蕾特征和花药颜色;将花药置于卡诺固定液中处理24 h后，用改良苯酚试剂染色，压片镜检花粉小孢子的发育时期。
1.2.2花药的预处理与培养将花蕾置于4℃冰箱，分别进行0、2、4、8和12 d的预处理。接种前，将花蕾用流水冲洗1—2h，常规消毒后用滤纸吸干表面水分，小心剥取花药，并接种于不同的培养基中进行培养。观察并记录愈伤组织诱导、不定芽分化与增殖、植株再生等情况。
1.2.3培养条件培养用基本培养基为MS，附加琼脂6.5 g -L“，蔗糖30g-L“，灭菌后pH值为5.8左右。培养室温度为(25土2)℃，光照强度为2 000~3 000ymol.m-2.s。1，每天光照12—14 h。1.2.4再生植株的倍性鉴定将试管苗叶片于流水中冲洗10 min，再用蒸馏水冲洗3次;切取叶边缘组织，并用0.002 mol.1-1 8一羟基喹啉预处理2h，于卡诺固定液中固定24 h;转入1 mol.L-l HCI中解离IO min，改良苯酚品红试剂染色20 min，压片、镜检染色体数目并拍照(段英姿等，2006)。同法取正常二倍体菘蓝试管苗为对照，进行染色体制片并计数、拍照。
2结果与分析
2.1小孢子发育时期的鉴定
镜检结果表明，花蕾直径小于0. 15 cm时，小孢子发育不成熟或处于单核早期，培养过程中，细胞分裂能力差，花药存活力低;直径大于0. 25 cm时，花蕾逐渐展开，花冠黄色，小孢子已发育至双核至三核期，不宜作为花药培养的外植体;而直径在0.15 N0. 25 cm之间的闭合花蕾，花冠呈淡绿色至淡黄色，50%以上的小孢子处于单核中期至后期(靠边期)。因此，菘蓝花药培养时，宜在取材当日选取健康、无病虫害，花冠颜色为淡绿至淡黄色，直径0. 15~0.25 cm、闭合花蕾中的花药作为单倍体诱导的适宜外植体。
2.2花药愈伤组织的诱导
2.2.1不同激素组合对花药愈伤组织诱导的影响 接种一周左右，部分花药开始膨大、纵裂并伴有愈伤组织的形成。随着培养时间的延长，整个花药完全脱分化成黄绿色、疏松的愈伤组织(图l：a)，并最终转为绿色、结构致密的愈伤组织(图1：b)，不同激素组合对愈伤组织诱导的影响作用如表1所示。
从表1可以看出，花药在MS附加6-BA 0.5mg.L-I和NAA l.0 mg.L-l的培养基中，经过6d的培养即可诱导愈伤组织形成，诱导率为20. 35 010;而添加了2，4-D的培养基组合中愈伤组织的诱导率分别在9. 30%到15. 00%之间不等。同时，添加2，4-D后愈伤组织的形成时间明显推迟至10 d以上，推测2，4-D对菘蓝花药愈伤组织的形成具有一定的抑制作用。因此，适宜菘蓝花药愈伤组织诱导的培养基为MS附加6一BA O.5 mg. L-1和NAA l.0 mg.L。2.2.2不同低温预处理对花药愈伤组织诱导的影响与对照组相比，适当的低温预处理能够在一定程度上提高愈伤组织诱导率，同时缩短愈伤组织的形成时间。如2 d( 23. 35%)和4d( 18. 57%)的低温预处理均较对照(15.26%)明显地提高了愈伤组织诱导率。在相同的培养基中，与2.2.1项的结果(20.35%)相比，2 d的低温预处理(23.35%)可以进一步提高愈伤组织诱导率;而较长的低温预处理时间会在一定程度上降低愈伤组织诱导率，并延长其形成时间。因此，适宜菘蓝愈伤组织诱导的低温预处理时间为2 d。观察结果表明，花药培养一段时间后，药隔处首先开裂，进而形成淡黄色的愈伤组织(图1：a)。培养初期愈伤组织生长缓慢，随后逐渐加快，7d左右愈伤组织块直径可达1.5 cm以上，颜色由淡黄转为淡绿，质地由疏松转为致密(图1：b)。
2.3花药愈伤组织的增殖、分化及完整植株的获得
将花药愈伤组织接种到MS附加6- BA1.0 mg.L-I和NAA 2.0 mg.L-l的培养基中，经过25 d左右的培养，愈伤组织旺盛生长并明显增殖。2—3次继代培养后，将其转入MS附加6-BA1.0 mg.L-I，NAA 0.5 mg.L-1的培养基中，6d左右可以见到绿色芽点的形成，芽点经进一步生长形成不定芽(图1：b)，且形成率达到80. 00%以上。每块愈伤组织上形成不定芽的个数不等，25 d时统计不定芽的平均增殖倍数约为8(图1：c)。待不定芽长至2～3 cm高时将其切下，转入1/2MS附加NAA l.0 mg.L。1的培养基中，3d左右即可生根(图1：d)，生根率为100%。待根长至4—5 cm长时(图1：e)，可以进行移栽。
2.4再生植株的倍性鉴定
从再生植株的形态和生长情况来看，经花药培养获得的单倍体植株较为弱小，且生长较慢;而二倍体植株形态正常，生长旺盛，在培养基中呈现优势生长。分别取对照和经花药培养所得植株的叶边缘进行染色体制片并计数，对其进行染色体倍性鉴定。从图l:f，g可以看出，经花药培养所得植株的染色体(n=7) 明显减少，为正常二倍体植株(2n= 14)的一半;而同一植株中部分细胞的染色体数目还存在9条、10条、13条等情况，说明在愈伤组织诱导过程中产生了一定数量的非整倍体。因此，对于菘蓝单倍体植株的选育仍有待进一步研究。
3讨论
低温处理可以有效地改变小孢子的配子体发育途径，启动孢子体发育途径，显著提高小孢子愈伤组织或胚状体的发生频率;在一定程度上延缓小孢子退化，提早雄核发育，增加参与雄核发育的小孢子的比率(Li等，2008)。不同植物花药低温预处理的时间不同，温度条件也存在差异。菘蓝花药培养的过程中，适宜的低温预处理能够提高愈伤组织诱导率，并缩短愈伤组织形成时间;但随着预处理时间的延长，诱导率会随之下降。在本研究中，低温预处理2d可以提高菘蓝花药愈伤组织诱导率。
研究结果表明，菘蓝花药愈伤组织诱导的适宜条件为MS口6-BA 0.5 mg -L。1和NAA l.0 mg -L。1，其诱导率为23.35%。与正常二倍体菘蓝叶片和叶柄的愈伤组织诱导结果(叶片和叶柄的愈伤组织诱导率分别为97. 50%和80. 00%，苗永美等，2008)相比，花药愈伤组织诱导率偏低。这可能与花药较高的分化水平、不同材料基因型的差异、以及培养条件等都有一定的关系。大多数禾本科植物，如水稻(李大林，2000)、小麦(裴翠娟等，1992)、大麦(魏凌基等，1995)等的花药培养中，2，4-D是启动小孢子细胞形成愈伤组织的必要条件。而菘蓝花药培养过程中2，4-D对愈伤组织的诱导表现出一定的抑制效应，这与大多数植物花药培养的研究结果不同，这种抑制效应的机制如何，尚有待于从物质代谢、激素水平和酶活性等方面进行较为深入地探讨。
迄今为止，未见有菘蓝花药培养及单倍体诱导的研究报道，本文从菘蓝花药低温预处理、激素组合等方面进行了研究，希望能为菘蓝的花药培养、单倍体诱导及育种等提供一定的研究依据。
