分子标记是被广泛应用于检测物质遗传性的一种方法，在农业生产中，也可以用来研究作物的遗传性状，本文主要探讨ILP分子标记分析籼粳杂交水稻的遗传多样性。
《中国水稻科学》为中国水稻研究所主办的全国性水稻学术性季刊，主要报道以水稻为研究对象的未经发表的中、英文原始论文。
水稻籼粳亚种间杂种一代蕴藏着巨大的杂种优势，福建农林大学作物遗传育种研究所进行了长期探索，认识到通过基因的不断聚合和累加，优良株型和高产与优质、抗逆性、适应性相结合是行之有效的选育实用型强优势籼粳亚种间杂交稻的育种策略，依据这一育种策略，构建了水稻籼粳亚种间育种系谱。
分子标记是检测种质资源遗传多样性的有效工具。常见的分子标记有：RFLP标记、RAPD标记、SSR标记、AFLP标记、CAPS标记、SNP标记、SSCP标记等，虽然它们各有许多优点，但都存在明显的不足之处。ILP(IntronLengthPolylnorphisms)标记即内含子长度多态性分子标记是基于己经测序的两个籼粳亚种基因组序列(Nippornbare和9311)上开发的一种新型分子标记，具有数量多(总数达5811个)、多态性高(在日本晴和9311之间为100%)、检测方便、结果稳定等优点，而且通用性好、单拷贝且共显性等优点。ILP标记作为一种新型的分子标记尚未有大量的报道。本研究利用ILP标记技术作为遗传多样性的研究手段探讨育种系谱的亲缘关系，对丰富分子标记在水稻遗传方面的应用和从分子水平揭示水稻类型均具有重要的理论意义，也为水稻超高产育种研究提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试材料
本研究以构建水稻籼粳亚种间杂交种质创新系谱中的20个亲本和30个不同阶段的育成品系为试验材料，用日本晴和93-11作为对照标记来揭示其遗传多样性。
1.1.2ILP引物
ILPs标记是根据已公布的籼稻品种9311和粳稻品种日本晴的全基因组序列开发的一种内含子长度多态性标记(Wangeta1.2005)，由吴为人教授惠赠。ILP引物从http://ibi.zju.edu.cn/ILPs/index.htm上获得籼粳特异引物，从5811个候选的ILP标记中研发出173个ILP标记，从中检测到60对ILP标记应用于水稻籼粳检测。引物合成来自上海生物工程有限公司(北京三博远志生物技术责任有限公司合成)，自编号分别为1-62号，共124个引物。
1.2实验方法
1.2.1亲本叶片DNA的提取
采用CTAB法并加以改进。
1.2.2PCR反应体系的建立
在冰盒上建立ILP的PCR反应体系(15μL)。即模板：DNA(50ng/μL)2.0μL;dNTP：(2.5mmol/L)0.3μL;引物：(50ng/ul)1.5μL;TaqDNA聚合酶：(5U/μL)0.15μL;MgCl：(10mmol/L)0.75μL;10×PCRBuffer：1.25μL;双蒸水：9.05μL。
1.2.3PCR反应程序
94℃预变性5min;94℃变性30s，59℃退火30s(每循环递解0.3℃)，72℃延伸1min，10个循环：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，10个循环;72℃延伸5min，4℃，保存。以上反应在PTC-200扩增仪上进行。
1.2.4电泳检测
PCR电泳检测：PCR扩增产物中加入3μL上样缓冲液，上样3μL，在DYCP-28D型电泳仪上进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶成分包括10%丙烯酰胺、0.04%过硫酸铵，0.1%TEMED，电泳缓冲液为0.5×TBE，250V电泳约1.5h。
1.2.5银染法显带，包括以下步骤：
将胶放入固定液(0.5%冰醋酸+10%乙醇)，固定时间3～5min，放入0.2%AgNo3中染色8min;再用蒸馏水水洗1min，洗2次，放入0.375mol/LNaOH+0.4%甲醛中显色，显色至条带清晰;保存在双蒸水或保存在保鲜膜中可短期保存。DNA片断的分子量大小根据L-2000DNAMarker电泳迁移距离估计。
1.3统计分析方法
采用人工计带法进行电泳结果记录，清晰可辨的电泳条带全部用于统计分析。对于同一引物的扩增产物，按扩增条带的有无计数，迁移率相同的条带记为一个位点，扩增阳性赋值为“1”，阴性赋值为“0”，从而把图形资料转换成数据资料并输入EXCEL2000中建立特征数据矩阵用于进一步分析。应用DPS统计软件，根据Nei-Li计算法求得品种间的相似系数Sij，计算公式为Sij=2Nij/(Ni+Nj)，其中Nij为品种i和品种j共有的带数，Ni和Nj分别为第i和第j品种各自的带数。采用类平均法(UPGMA)对其进行聚类并作图。
2结果与分析
2.1ILPs引物筛选与扩增
ILP在野生稻中的遗传多样性具有典型的籼粳亚种特性，能反应籼粳亚种间的遗传多样性。用60对ILP引物对52份亲本材料(日本晴、9311及50份籼粳材料)检测，在52份材料中共扩增到124个条带，每对引物分别扩增到2-4条，平均为2.01个条带。45(61.4%)对ILP标记只检测到2种等位基因条带，即9311带型(TypicalIndicaAllele,)和日本晴带型(TypicalJaponicaAllele)。
2引物3797
Fig.2primer3797
注：1-52分别代表9311，日本晴，KentaNangKa，嘉南9号，明恢72，2428，92gk729，97gk419，97gk1019，97gk1037，97gk2046，20gk719，47粳，华明921，WJ413，多系1号，亚恢420，明恢86，R527，MHR18，超引一号，9308，明恢398，明恢413，明恢416，明恢417，明恢419，明恢436，明恢3009，明恢502，明恢503，明恢504，明恢506，明恢507，明恢508，明恢509，明恢510，明恢511，明恢512，明恢513，明恢514，明恢515，明恢516，明恢517，明恢519，明恢523，明恢524，明恢527，明恢530，明恢532，明恢533，明恢534。
作进一步检测时，用筛选的58对ILP引物对52份试验材料进行扩增，其中引物2123和引物3797扩增结果见上图1、图2。
2.2系统聚类分析
由图3可知，从相似系数0.74处分开，供试的52个亲本和品系经58对水稻特异ILP引物的PCR扩增检测，可以明显地分为两大类;若从相似系数0.45处分开，供试的52个亲本和品系可分为7类。但为了更清晰的界定本材料的亲缘关系，本试验选定了从相似系数0.67处分开，可分为籼稻，中间型和粳稻三大类，这3种类中第三类最多，其中差异最大的品种间相似系数为0.51，籼型包含在该类型中，其相似系数较相近，它们之间差异不大;中间型包括4个品种;粳型虽包含较少品种(7个)，但它们之间的差异较大，差异最大的品种间相似系数也有0.67。
3讨论
由于环境因素的影响，传统的形态特征很难鉴定出种质资源的亲缘关系。本研究采用ILP分子标记对供试材料进行亲缘关系分析，由于ILP分子标记所用的引物长度一般在15-20bp左右，退火温度在55-60℃之间，保证了引物扩增的重复性和特异性，提高了分类结果的准确性，所以此方法作为籼粳亚种种质资源的聚类分析，结果比较稳定可靠，可为亲本选配提供可靠的分子水平信息。
同时，我们也要注意到标记数目的选择对结果的可靠性有很大的影响，标记数目太少，所获得的结果具有较大的随机性，并不能反映亲本之间的真实亲缘关系。而前人的诸多研究中，使用的标记数量都较少，段世华等选用分布于水稻12条染色体上的25对SSR标记，分析了生产中广泛应用的35个杂交水稻恢复系。朱作峰等用30对SSR标记比较了52份不同生态型的栽培稻和34份不同省(区)的普通野生稻的遗传多样性。谢建坤等利用14对SSLP标记对东乡野生稻进行多样性分析。和本研究相比，其他研究者在研究对象的数量上比本实验多出很多，这也决定了他们在标记数量的选择上不可能太多，但从本研究结果来看，标记数量的选择对结果具有很大的影响，只有标记数达到一定数量，所得结果才较为可靠。
基于50个籼粳种质资源的聚类结果，我们还可以从中选择第二、第五和第六类群(以分成七个类群为例)作深入的研究，即从第二类群粳稻品系中的第1号品系，第五类群13个籼型品系中的第5、6、11、13号品系，第六类群的籼型品系第13、24号，选择按不同年代育成主要以籼稻为主的共7个品系，作为恢复系进一步研究。通过对其产量和茎杆性状的遗传效应和杂种优势测定，分析亲本遗传特点与利用潜力，以便寻找到最优配置，为今后育种方案的制订提供依据。
参考文献
1 Grodzicker,T.et al.Physical mapping of Temeraturesensitive Mutations of adenoviruses Cold Spring HarborSymp[J].Quant.Biol,1974,39: 439-446.
2 Liu D L,Lovett J V,Biologically active secondary metabolites of barley.II.Phytotoxicity of barley allelochemicals[J].Journalof Chemical Ecology,1993,19:2231-2244.
3 赵向前.水稻内含子长度多态性分子标记的开发和应用[D].浙江大学,2007
4 卢泳全,汪旭升,黄伟素,等.基于水稻内含子长度多态性开发禾本科扩增共有序列遗传标记[J].中国农业科学,2006,39(3):9-15.
5 现代植物生理学实验指南[M]. 中国科学院上海植物生理研究所,上海市植物生理学会主编, 科学出版社, 1999, 337.
6 段世华,毛加宁,朱英国.用微卫星DNA标记对我国杂交水稻主要恢复系遗传差异的检测分析[J].遗传学报.2002.29(3):250-254.
7 朱作峰,孙传清,付永彩,等.用SSR标记比较亚洲栽培稻与普通野生稻的遗传多样性[J].中国农业科学,2002.35(12):1437-1441.
8 谢建坤,陈大洲,肖叶青,等.应用微卫星标记分析东乡野生稻遗传多样性[J].中国农业科学,2003,36(8):873-878.
