摘要：采用不同浓度的水杨酸、赤霉素和脱落酸处理泽泻植株，研究不同诱导子对泽泻中23-乙酰泽泻醇B积累的影响。结果表明，水杨酸、赤霉素和脱落酸在低浓度下都能促进泽泻中23-乙酰泽泻醇B的积累，在高浓度下则表现出一定的抑制作用。150 μg/mL的水杨酸处理第8天时，23-乙酰泽泻醇B的含量为715.4 μg/g，为所有处理中的最大值。赤霉素和脱落酸的处理效果与水杨酸相比较差。
关键词：农业期刊投稿,泽泻,23-乙酰泽泻醇B,诱导子
DOI：10.14088/j.cnki.ISSN0439-8114.2015.05.025
Abstract： In order to study the effect of different elicitors on the accumulation of alisol B 23-acetate in [Alisma orientale(Samuels)Juzep.]， A. rhizoma plants were treated by SA， GA and ABA with different concentration. The results showed that low concentration of SA， GA and ABA promoted the accumulation of alisol B 23-acetate， while the high concentration had inhibition. The content of alisol B 23-acetate was 715.4 μg/g， the highest content at the eighth day after treated by SA. Compared with SA， the effects of GA and ABA were poorer.
Key words： [Alisma orientale (Samuels) Juzep.]; alisol B 23-acetate; elicitor
泽泻是一种常见的中药材，是由泽泻科(Alismataceae)多年生植物泽泻[Alisma orientale(Samuels)Juzep.]的块茎干燥炮制而成。泽泻性味甘淡寒，归肾、膀胱经，具有利水渗湿、泄热和化浊降脂的功效，用于小便不利、水肿胀满、泄泻尿少、痰饮眩晕、热淋涩痛和高血脂等[1]。泽泻的主要化学成分为三萜类物质，其中最主要的药用成分为23-乙酰泽泻醇B[2]。近年来，随着人们对23-乙酰泽泻醇B的深入研究，发现23-乙酰泽泻醇B具有很多非常重要的生物活性[3]，如抗癌[4]、诱导多种肿瘤细胞的凋亡[5]和抑制乙肝病毒抗原活性[6]等作用。
诱导子(Elicitors)是一种特殊的诱发因子，能够开启植物体内代谢过程中酶的活性，因而能够显著地增加植物中次生代谢产物的含量，有时候甚至能诱导植物产生出新的次生代谢产物。目前，诱导子已经广泛应用于许多中药材次生代谢产物的生产中，如人参[7]、鱼腥草[8]、丹参[9]、藏红花、黄芩等。但是诱导子在泽泻中的研究却鲜有报道。为此，试验采用水杨酸、赤霉素和脱落酸三种诱导子分别处理泽泻，研究泽泻中23-乙酰泽泻醇B含量的变化。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于2013年7月至2014年1月在福建农林大学试验田进行，供试材料泽泻种子为福建中医药大学吴锦忠教授提供。泽泻种子于2013年7月8日播种育苗，苗期40 d，2013年8月18日移栽至大田，大田前作为水稻。
试剂：乙腈为色谱纯(德国Merck公司)，水为娃哈哈超纯水，标准品23-乙酰泽泻醇B购于国家标准物质信息中心，水杨酸、赤霉素、脱落酸、无水乙醇、石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等均为国产分析纯。
仪器：烘干箱(上海精宏)、FY135中草药粉碎机、BS124S 型电子天平、3200 IH 型超声波清洗器、UV 1700-1800紫外可见分光光度计(上海凤凰光学科技有限公司)、美国Waters 2695高效液相色谱仪、Waters 2996检测器。
1.2 方法
1)试验设计。选择植物形态、营养状况相近的盆栽泽泻植株45盆，3次重复，每个重复15盆。在相同的栽培条件，将15盆泽泻分成3组放置于水田中，每组5盆纵向摆放，保持40 cm的间距，每组喷施一种不同种类的诱导子(水杨酸、赤霉素、脱落酸)，每组中5盆植株喷施的诱导子的浓度分别为 0、50、100、150、200 μg/mL(诱导子都采用1%乙醇溶解)。喷施诱导子之前取样一次作为对照，之后在处理的第4、8、12、16天分别取样一次，采用高效液相色谱法检测各个样品中23-乙酰泽泻醇B的含量。
2)标准品溶液的制备。称取标准品23-乙酰泽泻醇B 4 mg，置于5 mL的离心管中，取4 mL色谱纯乙腈短暂超声混匀，制成1 mg/mL的标准品储备液。0.22 μm滤头过滤备用。
3)材料准备。泽泻样品在烘干箱中经60 ℃干燥至恒重。干燥后的样品用FY135中草药粉碎机粉碎，过80目筛，备用。精密称取样品粉末0.3 g，加入20 mL石油醚，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，滤纸过滤。滤液经旋转蒸发仪蒸干，加入1 mL色谱纯乙腈溶解蒸干的样品，溶液用0.22 μm滤头过滤，备用[10，11]。
4)统计分析。数据采用Excel和DPS软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 23-乙酰泽泻醇B的检测 采用高效液相色谱法检测，色谱柱：Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱温：室温;流动相：乙腈-水(80∶20，V/V);流速：0.8 mL/min，检测波长：208 nm;进样量：20 μL，进样时间：20 min[12，13]。结果见图1和图2。
2.2 方法学考察
2.2.1 精密度试验 精密吸取300 μg/mL的23-乙酰泽泻醇B标准品溶液，重复进样6次， 每次进样体积20 μL。测得23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD为1.70%，表明该仪器的精密度良好。
2.2.2 重复性试验 精密称取同一批的泽泻粉末6份，依照上述方法制备供试溶液，进样检测。结果表明23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD为1.74%，说明该方法重复性较好。
2.2.3 稳定性试验 精密称取泽泻粉末0.3 g， 依照上述方法制备供试溶液，分别在1、2、4、8、12 h进样检测，结果表明23-乙酰泽泻醇B峰面积的RSD为0.93%，说明从泽泻中提取的23-乙酰泽泻醇B在12 h内稳定性较好。
2.2.4 加样回收率试验 精密称取泽泻块茎粉末6份，每份0.3 g，其中3份加入0.2 mL的浓度为300 μg/mL的23-乙酰泽泻醇B标准品溶液，3份不加，依照上述方法制备供试溶液，进样检测。结果表明23-乙酰泽泻醇B的平均回收率为98.1%，RSD为3.10%。
2.3 23-乙酰泽泻醇B标准曲线的绘制
将23-乙酰泽泻醇B标准品储备液配制成25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的标准样品。按色谱条件，每个浓度进样20 μL，重复进样3次，取峰面积的平均值。以标准样品浓度X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线。23-乙酰泽泻醇B的标准曲线为=25 327 X-48 665，R2= 0.999 6，线性范围为25～500 μg/mL，结果见图3。
2.4 不同诱导子对泽泻中23-乙酰泽泻醇B积累的影响
2.4.1 水杨酸处理对23-乙酰泽泻醇B积累的影响 采用0、50、100、150、200 μg/mL五个不同浓度的水杨酸对盆栽泽泻进行处理，在处理的第0、4、8、12、16天分别取样，利用HPLC法测定样品中23-乙酰泽泻醇B的含量，结果如图4。
由图4可知，不同浓度的水杨酸处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量有一定的影响。50 μg/mL的水杨酸处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先上升后下降的趋势，并在第8天时23-乙酰泽泻醇B的含量达到最大值391.6 μg/g，是对照23-乙酰泽泻醇B含量的3.13倍。100 μg/mL的水杨酸处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先上升后下降的趋势，并在第8天时23-乙酰泽泻醇B的含量达到最大值420.2 μg/g，是对照23-乙酰泽泻醇B含量的3.36倍。150 μg/mL的水杨酸处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先上升后下降的趋势，并在第8天时23-乙酰泽泻醇B的含量达到最大值715.4 μg/g，是对照23-乙酰泽泻醇B含量的5.72倍。200 μg/mL的水杨酸处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先下降后上升的趋势，并在第8天达到了最低值66.7 μg/g，为对照23-乙酰泽泻醇B含量的53.3%。
采用DPS软件对不同浓度水杨酸处理后样品中23-乙酰泽泻醇B含量进行二因素方差分析，结果见表1、表2和表3。
由表1、表2和表3可知，150 μg/mL水杨酸处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量具有明显的促进作用，与对照相比差异极显著。100 μg/mL和50 μg/mL水杨酸处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量具有明显的促进作用，但与对照相比差异不显著。200 μg/mL水杨酸处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B含量具有抑制作用，但与对照差异不显著。处理时间对泽泻中23-乙酰泽泻醇B含量的影响作用不明显，只有第8天表现出明显的促进作用，与对照和16 d处理相比差异极显著，与其他处理相比差异显著。
2.4.2 赤霉素处理对23-乙酰泽泻醇B积累的影响
采用0、50、100、150、200 μg/mL五个不同浓度的赤霉素对盆栽泽泻进行处理，在处理的第0、4、8、12、16天分别取样，利用HPLC法测定样品中23-乙酰泽泻醇B的含量，结果如图5。
由图5可知，不同浓度的赤霉素处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量有一定的影响。50 μg/mL的赤霉素处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先上升后下降的趋势，并在第12天时23-乙酰泽泻醇B的含量达到最大值248.5 μg/mL，是对照23-乙酰泽泻醇B含量的1.79倍。100 μg/mL的赤霉素处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先上升后下降的趋势，并在第8天时23-乙酰泽泻醇B的含量达到最大值462.3 μg/g，是对照23-乙酰泽泻醇B含量的3.49倍。150 μg/mL的赤霉素处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先上升后下降的趋势，并在第8天时23-乙酰泽泻醇B的含量达到最大值285.3 μg/g，是对照23-乙酰泽泻醇B含量的2.15倍。200 μg/mL的赤霉素处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先下降后上升的趋势，并在第8天达到了最低值66.4 μg/g，是对照23-乙酰泽泻醇B含量的50.1%。
采用DPS软件对不同浓度赤霉素处理后样品中23-乙酰泽泻醇B含量进行二因素方差分析，结果见表4、表5和表6。
由表4、表5和表6可知，100 μg/mL赤霉素处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量具有明显的促进作用，与对照相比差异极显著。150 μg/mL和50 μg/mL赤霉素处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量具有明显的促进作用，但与对照相比差异不显著。200 μg/mL赤霉素处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B含量具有抑制作用，但与对照相比差异不显著。处理时间对泽泻中23-乙酰泽泻醇B含量的影响作用不明显，只有第8天表现出明显的促进作用，与对照和第16天相比差异显著，其他处理间均差异不显著。 2.4.3 脱落酸处理对23-乙酰泽泻醇B积累的影响 采用0、50、100、150、200 μg/mL五个不同浓度的脱落酸对盆栽泽泻进行处理，在处理的第0、4、8、12、16天分别取样，利用HPLC法测定样品中23-乙酰泽泻醇B的含量，结果如图6。
由图6可知，不同浓度的脱落酸处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量都是有一定的影响。50 μg/mL的脱落酸处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先上升后下降的趋势，并在第12天时23-乙酰泽泻醇B的含量达到最大值178.4 μg/mL，是对照23-乙酰泽泻醇B含量的1.20倍。100 μg/mL的脱落酸处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先上升后下降的趋势，并在第8天时23-乙酰泽泻醇B的含量达到最大值256.0 μg/g，是对照23-乙酰泽泻醇B含量的1.68倍。150 μg/mL的脱落酸处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先上升后下降的趋势，并在第8天时23-乙酰泽泻醇B的含量达到最大值393.6 μg/g，是对照23-乙酰泽泻醇B含量的2.59倍。200 μg/mL的赤霉素处理下，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先下降后上升的趋势，并在第12天达到了最低值102.7 μg/g，是对照23-乙酰泽泻醇B含量的69.1%。
采用DPS软件对不同浓度脱落酸处理后样品中23-乙酰泽泻醇B含量进行二因素方差分析，结果见表7、表8和表9。
由表7、表8和表9可知，150 μg/mL脱落酸处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量具有明显的促进作用，与对照相比差异极显著。100 μg/mL和50 μg/mL脱落酸处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量具有明显的促进作用，但与对照相比差异不显著。200 μg/mL脱落酸处理对泽泻中23-乙酰泽泻醇B含量具有抑制作用，但与对照相比差异不显著。处理时间对泽泻中23-乙酰泽泻醇B含量的影响作用不明显，只有处理第8天时与对照差异显著。
3 小结与讨论
试验结果表明，不同类型以及不同浓度的外源诱导子对泽泻中23-乙酰泽泻醇B的累积会产生一定影响，但其影响程度不同。从总体趋势来看，在使用诱导子处理后的一段时间内，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量呈先上升后下降的趋势。从浓度上看，3种不同的诱导子在低浓度下都能促进泽泻中23-乙酰泽泻醇B的积累，在高浓度下则表现出一定的抑制作用。
水杨酸是各种植物体内都普遍存在的一种小分子的酚类物质，大量试验证明，外源水杨酸进入植物体内，能够有效促进植物生长发育，诱导植物种子的萌发，调节植物体内乙烯的合成，诱导植物自身抗病、抗虫、抗干旱、抗盐胁迫等防御反应[14]。水杨酸通过对植物体内一系列生理生化反应的调节，最终能提高植物代谢产物的产量。本研究中水杨酸处理后，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量表现出明显的上升趋势，其中150 μg/mL的水杨酸处理第8天时23-乙酰泽泻醇B的含量为715.4 μg/g，为所有处理中的最大值。这些结果可能与水杨酸能够促进植物的生长发育和诱导植物的抗逆性有关。
赤霉素是一大类广泛存在的植物激素，具有很强的生物活性。在植物体内能够促进茎叶的伸长生长，加速细胞分裂，促进细胞纵向生长，抑制侧芽的休眠等[15]。本研究中赤霉素处理后，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量表现出明显的上升趋势，其中100 μg/mL的赤霉素处理第8天时23-乙酰泽泻醇B的含量为462.3 μg/g，诱导效果与水杨酸相比较差。
脱落酸作为一种重要的植物激素在植物的生长发育过程中起着重要的作用，能够促进植物叶片和果实的脱落、促使植物的芽休眠并且抑制其萌发、抑制植物生长、促进植物衰老等。脱落酸还能够诱导植物对各种不同的不良环境产生抗性，如抗旱性、抗病性、抗寒性和耐盐性等[16，17]。试验中脱落酸处理后，泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量表现出明显的上升趋势，其中150 μg/mL的脱落酸处理第8天时23-乙酰泽泻醇B的含量为393.6 μg/g，诱导效果与水杨酸相比较差。这种结果可能是由于脱落酸能够抑制植物的生长造成的。
参考文献：
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