摘要：为了检测重组蛋白SPAG11D的抑菌活性，提取牛睾丸组织总RNA，经RT-PCR扩增了SPAG11D基因，将该基因插入pET-32a(+)融合表达载体，并转入BL21(D3)进行原核表达，通过改变IPTG浓度和诱导时间优化表达条件，并用琼脂扩散法测定重组蛋白体外抑菌活性。结果显示，成功扩增牛SPAG11D基因，产物大小为390 bp，其序列与GenBank公布序列相一致;正确构建了原核表达载体pET-32a(+)-SPAG11D，重组蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度1.0 mmol /L、诱导时间为4 h;表达产物的分子质量约为33 kDa;该重组蛋白对霍乱弧菌具有明显的体外抑菌活性。本研究成功构建了牛SPAG11D基因的原核表达载体，并获得了具有抑菌活性的重组蛋白His-SPAG11D。
关键词：论文网,牛,原核表达,SPAG11D基因,抑菌作用
Abstract：In order to detect the antibacterial activity of recombinant proteinSPAG11D， the total RNA was extracted from the testis of bovine. The SPAGLLD gene was amplified by RT-PCR. After sequencing DNA， the gene was cloned into fusion expression vector pET-32a(+). The fusion protein of His-SPAG11D was produced under IPTG induction. The expression condition was optimized under inducement with different dosages of IPTG and inducement time. The in vitro antibacterial activity of the recombinant protein was detected by agar diffusion method. The results showed that the SPAGLLD DNA fragment with the length of 390 bp was successfully amplified. The sequence was consistent with the sequence on GenBank. The recombinant plasmid pET-32a(+)-SPAG11D was constructed successfully. The optimal expression condition was the IPTG final concentration of 1.0 mmol/L， with the induction time of 4 h. The molecular mass of expressed recombinant protein was about 33 kDa. The recombinant protein was significant in vitro antibacterial activity to Vibrio cholerae. It is indicated that the prokaryotic expression vector of SPAG11D gene from the testis of bovine was successfully constructed. The obtained recombinant protein His-SPAG11D had antibacterial ability.
Key words： bovine; prokaryotic expression; SPAGLLD gene; antibacterial activity
精子相关抗原11(Sperm associated antigen 11，SPAG11)是精子膜上的一种蛋白，也是β防御素的一种，由2个相互独立的β防御素基因通过通读转录连接到一起[1]，主要在哺乳动物的睾丸、附睾和雄性生殖道中表达。SPAG11被认为在雄性生殖道的先天免疫、精子的成熟以及透明带的识别和精卵结合等事件中起到重要的作用[2-4]。
雄性生殖系统的病原感染严重威胁其生殖和内分泌功能，如沙眼衣原体可以引起附睾炎并阻碍附睾内精子的运动[5]。而SPAG 11蛋白能够抵御病原微生物对机体生殖道的侵害。对人的SPAG11各蛋白亚型研究表明，其N-端都具有抗菌活性，而且人的SPAG11C蛋白抗大肠杆菌活性远大于该亚型N-端的抗菌活性[6，7]。此外还发现，猕猴的SPAG11蛋白也具有抗菌活性。
目前认为SPAG 11在精子通过附睾的过程中参与精子的成熟。Zhou等[4]发现大鼠附睾头部的SPAG11E蛋白结合在精子的头部，在附睾尾部的蛋白结合在精子顶体后部，这表明SPAG11E蛋白在精子通过附睾时对精子起一定的修饰作用，此外SPAG11E蛋白能够提高未成熟精子的运动能力。
在牛体内共发现6种SPAG11蛋白亚型：SPAG11C、SPAG11D、SPAG11E、SPAG11U、SPAG11V、SPAG11W[8]，它们存在于睾丸、附睾、输精管上皮以及非生殖道组织中。余树民等[9]在牦牛生殖器官中也检测到了这6个亚型的表达。 1 材料与方法
1.1 试剂
Trizol试剂购自Invitrogen公司;cDNA反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、Hind III和 BamH I限制性内切酶均购自TaKaRa公司;T4 DNA连接酶购于Biolabs公司;EasyPure Plasmid MiniPrep Kit质粒快速提取试剂盒、EasyPure Quick Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;TEMED购自Amresco公司;异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自Merck公司;氨苄青霉素(Amp)购自Sigma公司;丙烯酰胺、过硫酸铵、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)等均为国产分析纯试剂。
1.2 菌种和质粒
E. coli DH5α、BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司;pET-32a(+)、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌O139、大肠杆菌O157、大肠杆菌K88、大肠杆菌K199和沙门氏菌为本实验室保存。
1.3 试验动物
刚出生的小公牛。
1.4 引物设计
根据GenBank上公布的牛抗精子抗体SPAG11D(KC899318.1)基因的核苷酸序列设计特异引物：P1： 5′-CGGGATCCATGAAGCAATTCCTCGC -3′，P2：5′-CCCAAGCTTCTAGGTGCCTGATCTG-3′
1.5 SPAG11D基因的克隆和测序
取小公牛睾丸和附睾组织，于液氮中保存。RNA提取参照文献[10]的方法提取组织的总RNA，以Olig(dT)为引物反转录生成第1链cDNA。以P1、P2为引物扩增SPAG11D基因。反应体系(20 μL)如下：ddH2O 7.4 μL，模板2 μL，P1和P2 (10 pmol/L)各0.3 μL，TaqDNA聚合酶10 μL。反应条件如下：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
用DNA凝胶回收试剂盒回收SPAG11D基因的PCR产物，连接于克隆载体PUC57，构建 PUC57-SPAG11D质粒并转化DH 5α感受态细胞，提取重组质粒，经双酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序。
1.6 原核表达载体的构建
用Hind III和BamH I 双酶切PUC57-SPAG11D，再克隆到原核表达载体pET-32a(+)的Hind III和BamH I位点之间，构建重组表达质粒pET-32a(+)-SPAG11D，转化DH5α感受态细胞，经双酶切鉴定筛选得到阳性克隆。
1.7 重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化
将鉴定好的重组质粒和空载体质粒pET-32a(+)分别转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中。挑取单菌落，接种到3 mL含Amp的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜。取活化后的菌液0.l mL加入到10 mL LB液体培养基中，37 ℃、 200 r/min振荡培养2～3 h，当菌液OD600 nm为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度1.5 mmol/L，继续振荡培养，分别取1 mL诱导0、3、4和5 h的菌液，12 000 r/min离心2 min，收集菌体，加入40 μL灭菌ddH2O，再加入等体积2×SDS加样缓冲液，混匀，煮沸5～10 min，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达情况。
分别用不同的IPTG剂量(终浓度为1.0、1.5、2.0 mmol/L) 和诱导时间(3、4、5 h)进行表达条件的优化。优化表达条件后，进行15% SDS-PAGE分离，经考马斯亮蓝染色、数次脱色后拍照观察结果。
1.8 抑菌活性测定
收集诱导表达的细菌，压力破碎后离心收集上清液。利用琼脂扩散法检测重组蛋白的体外抑菌活性：金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌O139、大肠杆菌O157、大肠杆菌K88、大肠杆菌K199和沙门氏菌于LB液体培养基中，37 ℃摇床振荡培养12 h。调整菌液浓度为108 CFU/mL;再将菌液稀释适当倍数。将稀释后的菌液均匀涂布于平板上。待琼脂表面水分干燥后，用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，吸取上清液0.16 mL至牛津杯中。平皿放置4 ℃冰箱扩散8 h，转入37 ℃温箱中10～12 h后观察并测定抑菌圈的大小。
2 结果与分析
2.1 SPAG11D基因的PCR扩增
SPAG11D基因的PCR的产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示大小约 390 bp左右的片段，与预计的片段大小相符(图1)。
2.2 克隆载体的构建及鉴定
将SPAG11D基因的PCR产物连接于克隆载体PUC57，转化大肠杆菌DH5α，经双酶切鉴定后测序。双酶切结果如图2所示，测序结果与GenBank上发表的序列相一致。
2.3 表达载体的双酶切鉴定
经测序鉴定正确的克隆载体经Hind III和BamH I双酶切，克隆至原核表达载体pET-32a(+)上，构建表达载体pET-32a(+)-SPAG11D，转化DH5α感受态细胞，经双酶切鉴定筛选得到阳性克隆(图3)。
2.4 原核表达产物的检测及条件优化
将含有质粒pET-32a(+)-SPAG11D阳性克隆菌分别在37 ℃条件下经IPTG诱导后，用15% SDS-PAGE对表达产物进行分析。诱导后在33kDa左右处有一明显蛋白带，与预期的大小相符，而未诱导菌没有同样大小的特征带，说明目的基因成功表达(图4、图5)。诱导最佳时间为4 h，诱导最佳IPTG浓度为1.0 mmol/L。 2.5 重组蛋白抑菌活性测定
检测了表达的重组蛋白在体外对霍乱弧菌O139、大肠杆菌K199、K88、O157、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌性。结果显示，重组蛋白对霍乱弧菌的生长有抑制作用(图6)。
3 讨论
睾丸、附睾和精囊等生殖道的感染严重威胁雄性的生殖和内分泌功能[2]。泌尿生殖道微生物大多数为表皮葡萄球菌和棒状杆菌，少数为革兰阴性杆菌、大肠杆菌、支原体、衣原体等[11]。其中大肠杆菌可引起40%～70%的精子活动凝聚，使精子活力下降，从而影响生育[12]。防御素是存在于哺乳类动物体中的抗微生物肽，在天然免疫过程中起到重要的作用，而且对机体无毒副作用。SPAG11蛋白是β防御素的一种，对人、猴的研究表明一些SPAG11蛋白亚型对大肠杆菌、奈瑟菌、肠球菌和葡球菌具有很好的杀伤能力。本研究表达的融合蛋白对霍乱弧菌具有明显的生长抑制现象，表明牛SPAG11D蛋白具有抗菌活性，与其他物种具有类似的抗菌功能。牛SPAG11D蛋白可能在抵御病原菌侵害雄性生殖道方面发挥重要的作用。
SPAG11在精子成熟过程中可能起到重要的作用，未成熟精子不具有运动能力，Zhou等[4]发现大鼠附睾中未成熟精子与附睾上皮细胞或能表达SPAG11E(Bin1b)的小肠上皮细胞共同培养后具有了运动能力，而加入SPAG11E抗体后，未成熟精子不具有运动能力;此外还发现，精子的运动能力随SPAG11E表达量的降低而下降。牛的SPAG11D存在于发育后期的精子细胞中，且在精子细胞的尾部[8]，与大鼠SPAG11E相类似，可能与精子的运动能力相关。
鉴于牛SPAG11D在抵御微生物对机体的侵害和生殖功能方面起到重要作用，本研究表达了牛SPAG11D融合蛋白，且具有很强的抑菌生物活性，而在生殖方面的功能将进一步分析研究。
参考文献：
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