在动物养殖的过程中难免 会遇到一些动物疾病，养牛过程中牛也会有各种各样的问题，牛病毒性腹泻也是很严重的一种传染病，在发现的初期就要进行合理的治疗，不然会带来很大的损失。本文是一篇畜牧养殖论文范文，主要论述了牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定。
摘要：牛病毒性腹泻病毒是牛病毒性腹泻-黏膜病的重要病原体，该病毒病是极为复杂、呈多临床类型表现的传染病，给世界养牛业造成了巨大的经济损失。本研究从疑似牛病毒性腹泻-黏膜病的粪便中分离得到一株病毒能使MDBK细胞产生细胞病变，经RT-PCR检测及扩增产物测序进一步证实，该病毒为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒，TCID50测定该病毒的滴度为107.15TCID50/ml。该病毒株的分离鉴定为牛病毒性腹泻病毒疫苗的研制奠定了基础。
关键词：牛病毒性腹泻-粘膜病病毒,分离,鉴定
牛病毒性腹泻-黏膜病 (Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease，BVD-MD) 是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV)感染而引起的一种重要传染病，临床上以发热、腹泻、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、持续感染与免疫耐受、免疫抑制、怀孕母牛流产、产死胎和畸型胎以及致死性黏膜病为主要特征[1，2]。该病呈世界性分布，广泛存在于美国、澳大利亚、英国、新西兰、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度等国家[3]。BVDV不仅可感染牛，也能感染绵羊、山羊、猪、鹿和其它反刍动物。1946年美国人Olafson等首次发现并分离出BVDV，1983年我国李佑民等首次从流产胎儿的脾脏中分离到BVDV。BVDV属于黄病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒属(Pestivirus)，与猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)和绵羊边界病毒(Border Disease Virus，BDV) 同属，存在抗原相关性，在血清学上存在着交叉反应，而且能够突破宿主特异性发生交叉感染[4]。根据BVDV病毒基因组5′端非翻译区(5′NTR)序列比较，把BVDV分为牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型(BVDV-Ⅰ)和牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型(BVDV-Ⅱ)[5，6]。根据BVDV可否使体外培养的传代上皮细胞发生病变效应，可分为两个生物型(biotype)：致细胞病变型(cytopathic，CP)和非致细胞病变型(noncytopathic，NCP)[7]。两种生物型的病毒虽然与宿主细胞的作用不同，但BVDV只有一种血清型。BVDV感染情况复杂，持续性感染个体症状隐蔽。动物带毒率高，特别是BVDV严重影响感染动物的繁殖，因此给全球畜牧业造成了巨大的经济损失[8]。因而被世界动物卫生组织(OIE)列为发病必须上报的动物传染病之一。本研究采集山东省某牛场发生严重腹泻症状的病牛的粪便，并对其进行了分离和鉴定，BVDV山东株的获得为BVDV疫苗的研究奠定了基础。
1材料与方法
1.1材料
牛肾细胞(MDBK )由山东省农业科学院奶牛研究中心实验室保存;DNA Marker DL2000 购于上海生工生物工程技术服务有限公司;DMEM细胞培养基、新生马血清、胰蛋白酶为HyClone公司生产;MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit，TaKaRa pimeScriptTM RT-PCR Kit，LA Taq酶，dNTP， RNA酶抑制剂，均购于宝生物工程(大连) 有限公司。病料样品为山东省某牛场发生严重腹泻症状的病牛的粪便。
1.2病毒培养
1.2.1病料的处理取腹泻奶牛粪便，用PBS(含10% 双抗) 1∶5 稀释。3 000 r/min 离心10 min，得到的上清液经0.22 μm 滤膜过滤除菌后得到病料处理液。
1.2.2病毒的接种选择生长旺盛的MDBK单层细胞，弃去营养液。按细胞培养瓶1%的量接种病料处理液后37℃感作1 h，弃去感作液，加入维持液(2%新生马血清的DMEM)于5%CO2、37℃培养。12 h观察细胞病变，培养24 h后收毒。细胞毒反复冻融3次后再次接种MDBK 细胞，如此传3代，收获的细胞毒用于其它试验。
1.3RT-PCR 鉴定及序列测定分析
1.3.1引物的设计合成根据已发表的BVDV NADL 株、Osloss 株、Orengon C24 等毒株的全序列的5′UTR保守区设计BVDV检测引物及分型引物[9，10]，引物序列信息见表1，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。稀释成20 μmol/L，-20℃保存。
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