摘要:从制糖厂废液污泥中分离筛选得到具有高絮凝活性的絮凝菌株 WSZ03，采用分子生物学结合形态学特征对 WSZ03 菌株进行鉴定，通过内转录间隔区( internal transcribed spacer，简称 ITS) 序列分析结合形态学观察确定 WSZ03 属曲霉属。探讨利用糖蜜乙醇废液对其进行廉价培养及同时处理糖蜜乙醇废液的可行性。结果表明，该菌株培养 48 h 的菌液适合作为絮凝菌种; WSZ03 絮凝菌对糖蜜乙醇废水的最佳絮凝条件如下: 接种量 2% 、培养时间 36 h、温度 28 ～ 34 ℃，pH 值 6。糖蜜乙醇废水的化学需氧量( chemical oxygen demand，简称 COD) 去除率达到 75. 00% ，色度去除率为 62. 50% ，浊度去除率为 88. 89% 。
关键词:絮凝菌; 糖蜜乙醇废液; 廉价培养; 絮凝条件
糖蜜乙醇废水是以糖厂制糖副产品糖蜜为原料，在发酵生产乙醇过程中产生的高浓度有机废水，含有大量碳水化合物、脂肪、蛋白质、纤维素等有机物，如果直接排放，会造成水体富营养化，其结果是水体黑臭，甚至失去功能，从而严重影响环境[1 - 2]。目前，该类废水的常规处理方法为生化处理法、化学处理法或多种方法的组合工艺等[3]。微 生 物 絮 凝 剂 ( MBF) 是利用生物技术，从微生物体或其分泌物中提取纯化而获得的一种天然高分子絮凝剂，该类絮凝剂可使液体中不易降解的固体悬浮颗粒发生凝聚沉降，是具有生物分解性和安全性的高效、无毒、无二次污染的绿色水处理剂。近年来，有不少学者报道了微生物絮凝剂在污水处理中的应用[4 - 10]，但是由于 MBF 制备成本高，产量低，生产菌种筛选困难，导致目前微生物絮凝剂多处于实验室研究阶段，在工业上并未得到广泛推广。因此，寻找廉价、高效的微生物絮凝剂生产方法，能有效地推动其广泛应用。针对上述问题，本研究以糖蜜乙醇废水为培养基主要成分，从糖厂废液污泥中筛选对糖蜜乙醇废水具有絮凝活性的絮凝菌，通过比较废水处理前后的化学需氧量 ( chemical oxygen demand，简称 COD) 、浊度、色度的变化，对絮凝菌的最佳絮凝条件进行优化，以得到对糖蜜乙醇废水较理想的处理效果。
1 材料与方法
1. 1 菌种来源与培养基
菌种: 从宜州博庆公司怀远糖厂的废水污泥中筛选得到。固体培养基: 10 倍液糖蜜乙醇废液 1 000 mL，琼脂粉 20 g，调节 pH 值为 7. 0。液体培养基: 10 倍液糖蜜乙醇废水，调节 pH 值为 7. 0。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 菌种分离与筛选
采用稀释涂布法将污泥进行梯度稀释，并涂布在灭菌的平皿培养基上，置于 28 ℃ 恒温培养箱中培养 3 ～ 5 d，用划线法纯化得到单一菌落，将纯菌落接种于装有 50 mL 液体培养基的 250 mL 摇瓶中，于 28 ℃、80 r/min 摇床中振荡培养 48 h 得到菌株发酵液，测定菌株发酵液和初始液体培养基的吸光度，进行絮凝活性的初步分析。
1. 2. 2 絮凝率的测定
吸取静置 20 min 的菌株发酵上清液，采用二极管阵列分光光度计，在550 nm 处测定吸光度( 以 D550 nm( B) 表示) ，取稀释 10 倍的糖蜜乙醇废液，以 550 nm 处的吸光度( 以 D550 nm( A) 表示) 为对照，计算絮凝菌的絮凝率: 絮凝率 = ( D550 nm( A) - D550 nm( B) ) /D550 nm( A) × 100% 。
1. 2. 3 菌种鉴定
采用平板划线法获得单菌落，观察菌落生长形态，并借助显微镜观察菌丝和孢子形态，以初步鉴定菌属，同时结合基因序列的测定确定菌属，其中基因序列的测定先使用生工生物工程( 上海) 股份有限公司的 DNA 提取试剂盒提取目标菌株的基因组 DNA，以 ITS1 + ITS4 作为扩增真菌内转录间隔区( internal transcribed spacer，简称 ITS) 的通用引物，交由生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序，再将所得测序结果提交至美国国立生物技术信息中心( National Center for Biotechnology Information，简称 NCBI) 网站进行 BLAST 比对分析。
1. 2. 4 絮凝条件的优化
1. 2. 4. 1 单因素试验
考察接种量、培养时间、培养温度和初始 pH 值等 4 个因素对 WSZ03 絮凝效果的影响。 ( 1) 接种量。将于 28 ℃、80 r/min 摇床中振荡培养 48 h 得到的菌液作为种子液( 菌体浓度 104 CFU/mL) ，接入糖蜜乙醇废液装液量为 50 mL 的 250 mL 三角瓶中，接种量分别为 1% 、2% 、4% 、6% 、8% 、10% ，在摇床中振荡培养，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液、发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。 ( 2) 培养时间。在 250 mL 三角瓶中加入 50 mL 糖蜜乙醇废水，再接入种子液，接着于 28 ℃、80 r/min 摇床中分别培养 6、12、18、24、30、36、42、48 h，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液、发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。 ( 3) 培养温度: 在 250 mL 三角瓶中加入 50 mL 糖蜜乙醇废水，接 入 种 子 液，接 着 分 别 在 22、25、28、31、34、37 ℃ 下 80 r/min 摇床中振荡培养，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液和发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。 ( 4) 初始 pH 值: 在 250 mL 三角瓶中加入 50 mL 糖蜜乙醇废水，利用 1 mol /L HCl、1 mol /L NaOH 分别调节 pH 值为 3、4、5、6、7、8、9、10 后接入种子液，接着在 28 ℃、80 r/min 摇床中振荡培养，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液、发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。
1. 2. 4. 2 正交试验
设计接种量、絮凝时间、温度、初始 pH 值等 4 个因素的 3 个水平，考察影响絮凝率的条件，以得出絮凝菌的最佳絮凝条件，因素水平设计见表 1。
1. 2. 5 处理糖蜜乙醇废水 在最佳絮凝条件下，用絮凝菌对糖蜜乙醇废水进行处理，比较处理前后水质的参数变化，衡量水质参数的指标为 COD、色度和浊度。采用 COD 测定计( 型号: A - 7325) 测量 COD，采用浊度仪 ( 型号: BTCJ - TSS) 测量浊度，利用色度计( HI93727 色度比色计) 测定色度。
2 结果与分析
2. 1 絮凝剂产生菌的选择
从宜州博庆公司怀远糖厂的废水污泥中经初筛、复筛分离纯化得到 1 株具有高絮凝活性的菌株，其絮凝率为 92% ，因此选择该菌株用于后续试验。
2. 2 絮凝剂产生菌的鉴定
菌种形态学观察及 ITS 序列的测序鉴定: 在固体培养基上于 28 ℃培养 2 d，可见白色菌丝，3 d 开始产生孢子，5 d 时孢子成熟。菌落直径约为 3 cm，正面干燥蓬松，呈灰棕色( 图 1 - a) ; 孢子呈圆形、灰色( 图 1 - b) 。结合 ITS 测序结果( ITS 片段长度为 760 bp，图 2) ，初步判断 WSZ03 菌株属于曲霉属。
2. 3 SWZ03 的絮凝率曲线于稀释
10 倍的糖蜜乙醇废液培养基中接入 1% 絮凝菌孢子悬液，不同培养时间段对糖蜜乙醇废液的絮凝效果见图 3。可以得出，该菌培养在 48 h 时达到较高的絮凝活性，通过测定菌体湿质量可知，此时菌体的生物量也已经达到最高水平。因此，后续试验均采用培养 48 h 的菌液作为菌种。
2. 4 接种量对 WSZ03 絮凝效果的影响
采用“1. 2. 4. 1”节中的试验方法，考察接种量、培养时间、培养温度和初始 pH 值等 4 个因素对絮凝菌絮凝效果的影响。由图 4 至图 7 的单因素絮凝试验结果表明，接种量对絮凝活性的影响不大，当接种量为 2% 时，絮凝效果明显; 当培养时间为 36 h 时，絮凝率较高; 培养温度对絮凝活性的影响亦不明显，31 ℃ 时的絮凝率较高; 当初始 pH 值为 6 时，絮凝率较高。
2. 5 絮凝条件的正交试验
按照“1. 2. 4. 2”节的试验方法对以上影响絮凝效果的 4 个因素做 4 因素 3 水平正交试验。由表 2 可知，4 个因素极差从小到大的顺序为时间 < 温度 < 接种量 < pH值，因此可见，4 个因素对 WSZ03 菌株絮凝效果的影响程度排序为 pH 值 > 接种量 > 温度 > 时间。结合单因素试验结果，综合分析得出絮凝菌的最优絮凝条件如下: 接种量为 2% ，絮凝时间为 36 h，温度为 28 ～ 34 ℃，pH 值为 6。
2. 6 糖蜜乙醇废水的处理利用
“2. 5”节中确定的最优絮凝条件，测定怀远糖厂糖蜜乙醇废水经 WSZ03 絮凝处理后的 COD、浊度和色度去除率。由图 8 可知，糖蜜乙醇废水的 COD 去除率达到 75. 00% ，色度去除率为 62. 50% ，浊度去除率为 88. 89% 。菌株 WSZ03 对糖厂糖蜜乙醇废液有较好的处理效果，尤其对浊度的清除效果比较明显。
3 结论与讨论
本研究利用糖蜜乙醇废液对微生物絮凝菌进行廉价培养，同时考察处理糖蜜乙醇废液的可行性。本试验的优势在于降低了微生物絮凝剂的培养成本。结果表明，本研究筛选出的 WSZ03 菌株对糖厂糖蜜乙醇废水有明显的絮凝效果。菌株 WSZ03 对糖蜜乙醇废水的最佳絮凝条件如下: 接种量为 2% ，时间为 36 h，温度为 28 ～ 34 ℃。菌株 WSZ03 所产絮凝活性物质对糖蜜乙醇废水 COD 的去除率为 75. 00% ，色度去除率为 62. 50% ，浊度去除率为 88. 89% 。笔者所在团队利用 WSZ03 菌株处理其他种类废水，如重金属废水、煤泥废水等发现，WSZ03 菌株絮凝剂有宽泛的适用范围，具有一定的实际应用前景。糖蜜乙醇废液含有大量难降解的有机物，并且色度高，通过单一絮凝菌株处理很难实现达标排放，因此在实际应用中，需要考虑采用混合菌种产生的复合絮凝剂以增强糖蜜乙醇污水的处理效果，或者与其他处理技术联合使用，进行污水处理研究。
参考文献: [1]Mudoga H L，Yucel H，Kincal N S. Decolorization of sugar syrups using commercial and sugar beet pulp based activated carbons[J].
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