[摘要]采用大鼠在体肠单向灌流实验模型，利用HPLC-ELSD测定肠灌流液中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖和巴戟甲素等5种低聚糖的含量，研究各低聚糖在小肠段(十二指肠、空肠、回肠)和结肠的吸收情况，并考察药物浓度、灌流液pH以及P-糖蛋白(P-gp)抑制剂对药物吸收的影响，得出各低聚糖成分在大鼠体内的肠吸收机制。结果显示5种低聚糖均为全肠道吸收的药物，吸收速率与灌流液pH、药物浓度和肠段部位有关。盐酸维拉帕米可显著增加蔗糖与巴戟甲素的吸收量，提示蔗糖与巴戟甲素是P-gp的底物。5种低聚糖在大鼠肠道内的吸收机制以被动扩散方式为主，不存在饱和吸收，其在全肠段的吸收均较好，吸收部位主要在十二指肠和空肠。
[关键词]临床医学论文,巴戟天低聚糖,肠吸收,单向灌流法,P-糖蛋白
Study on intestinal absorption features of oligosaccharides in
Morinda officinalis How.with sigle-pass perfusion
DENG Shao-dong1， ZHANG Peng2， LIN Li2*， XIAO Feng-xia2， LIN Jing-ran2
(1.The Second School of Clinical Medicine， Guangdong Medical College， Dongguan 523808， China;
2. College of Chinese Materia Medica， Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China)
[Abstract]To study the in situ intestinal absorption of five oligosaccharides contained in Morinda officinalis How. (sucrose， kestose， nystose， 1F-Fructofuranosyinystose and Bajijiasu). The absorption of the five oligosaccharides in small intestine (duodenum， jejunum and ileum) and colon of rats and their contents were investigated by using in situ single-pass perfusion model and HPLC-ELSD. The effects of drug concentration， pH in perfusate and P-glycoprotein inhibitor on the intestinal absorption were investigated to define the intestinal absorption mechanism of the five oligosaccharides in rats. According to the results， all of the five oligosaccharides were absorbed in the whole intestine， and their absorption rates were affected by the pH of the perfusion solution， drug concentration and intestinal segments. Verapamil Hydrochloride could significantly increase the absorptive amount of sucrose and Bajijiasu， suggesting sucrose and Bajijiasu are P-gp′s substrate. The five oligosaccharides are absorbed mainly through passive diffusion in the intestinal segments， without saturated absorption. They are absorbed well in all intestines and mainly in duodenum and jejunum.
[Key words]oligosaccharide extracted from Morinda officinalis; intestinal absorption; single-pass intestinal perfusion; P-glycoprotein
doi：10.4268/cjcmm20150126
巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How. 的肉质根，归肾、肝经，具有补肾助阳之功效，自古被誉为“补肾阳之要药”，已证实巴戟天糖类物质含量近50%，其中以低聚糖类成分为主[1]。近期药效研究表明，巴戟天低聚糖(oligosaccharide extracted from Morinda officinalis，OMO)可显著提高拟痴呆大鼠的学习记忆能力[2]、改善痴呆症状[3]，其中巴戟甲素、耐斯糖等低聚糖单体活性成分也显示具有神经细胞保护作用[4]、抗抑郁[5]、抗骨质疏松[6]等多种生物活性，表明巴戟天低聚糖类成分具有显著的开发利用前景。目前，以巴戟天为原料开发出的药品均以口服剂型为主，如巴戟天寡糖胶囊、巴戟口服液等，然而关于巴戟天低聚糖的胃肠道吸收机制研究的报道较少。因此，本研究采用大鼠在体肠单向灌流模型考察该巴戟天低聚糖有效部位中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖和巴戟甲素等5种低聚糖类成分的大鼠肠吸收特点，以揭示巴戟天低聚糖类成分的肠道吸收机制，确定各成分的最佳吸收部位，并考察了P-gp对巴戟天低聚糖类成分吸收的影响，以期为巴戟天低聚糖类药物的剂型开发及其在临床上的合理用药提供科学依据。 1材料
1.1试药
巴戟天低聚糖(OMO，自制，经鉴定纯度>95%);蔗糖(广东光华化学，批号20060717)，蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖(日本WAKO公司，批号分别为295-64111，292-64121，299-64131)，巴戟甲素(按专利201010224513.2方法自制)，纯度均>98%;盐酸维拉帕米(中国食品药品检定研究院，批号100223-200102);乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merk公司);空白灌流液( Krebs-Ringer′s营养液，自配，每升含NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.12 g，MgCl2 0.02 g，NaH2PO4 0.32 g，NaHCO3 1.37 g，用NaOH或H3PO4调节pH);氨基甲酸乙酯、三乙胺等试剂均为国产分析纯;实验用水均为自制超纯水。
1.2仪器
美国WATERS 2695型液相系统配备WATERS 2424型蒸发光散射检测器，BP211D型电子分析天平(德国Sartorius公司)，Genpure超纯水系统(德国TKA公司)，HH-S6数显恒温水浴锅(常州普天仪器公司)，BT100-1F数显恒流泵(保定兰格恒流泵有限公司)，PHB-3型pH计(上海三信仪表厂)，KQ-500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，佳美SK-1快速混匀器(江苏金坛市佳美仪器厂)，TGL-16aR型台式冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1.3动物
雄性SD大鼠，体重200～250 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2008-0020，实验前动物禁食12 h，自由饮水。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱采用Waters XBridgeTM Amide(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，柱温40 ℃，以乙腈为流动相A，0.2%三乙胺溶液为流动相B，梯度洗脱0～25 min，75%～65%A;25～55 min，65%～60%A;55～56 min，60%～25%A;56～60 min，25%A;60～63 min，25%～75%A;63～70 min，75%A;流速0.6 mL・min-1;漂移管温度90 ℃;喷雾器模式加热，100%;气压40 Pa;增益20倍;进样体积10 μL。
2.2对照品溶液的制备
精密称取蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、巴戟甲素对照品适量，加入空白灌流液制得每1 mL含蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、巴戟甲素分别为2.03，3.01，4.30，5.90，10.0 mg的混合对照品储备液，备用。
2.3样品处理
取样品液2 mL，置于4 ℃离心机中1万 r・min-1，7 250×g离心10 min，取上清液过0.22 μm水系微孔滤膜，取续滤液10 μL 直接进样。
2.4方法学考察
2.4.1专属性实验分别取空白灌流液、含OMO的灌流液、经灌流后含OMO的样品液、含维拉帕米的灌流样品液及混合对照品储备液，按2.3项下处理，进样分析，见图1。
2.4.2标准曲线制备分别取2.2项下对照品储备液0.25，0.50，1.0，2.0，2.5 mL置于5 mL容量瓶中，以空白灌流液定容至刻度，摇匀后，按2.3项下处理， 进样10 μL。以各成分进样质量X(ng)的对数值(lgX)为横坐标，以其峰面积积分值Y的对数值(lgY)为纵坐标绘制标准曲线，求得回归方程，见表1。
2.4.3精密度及回收率精密量取2.2项下对照品储备液适量，以空白灌流液稀释，分别配制得蔗糖(0.101 5，0.406 0，1.015 g ・L-1)、蔗果三糖(0.150 5，0.602 0，1.505 g ・L-1)、耐斯糖(0.215 0，0.860 0，2.150 g ・L-1)、1F-果呋喃糖基耐斯糖(0.295 0，1.180，2.950 g ・L-1)、巴戟甲素(0.500 0，2.000，5.000 g ・L-1)不同质量浓度的混合对照品溶液，按2.3项下处理，平行制备5份，于
同一天内测定5次和5 d内分别测定，计算方法回收率、日内和日间精密度(用RSD表示)，见表2。
2.4.4灌流液中低聚糖类成分的稳定性考察取大鼠禁食12 h后，用空白灌流液进行大鼠在体单向肠灌流，取0～120 min内肠灌流液。精密称取适量OMO，以上述肠灌流液溶解后在37 ℃水浴中放置
12 h，分别于0，2，4，8，12 h取样，按样品处理方法进行处理后进样分析，以各时间点的峰面积与0 h的峰面积比值作为剩余百分含量，考察其稳定性。计算得各组分平均剩余含量均大于95%，RSD均小于2.1%，结果表明，12 h内各待测物含量未发生明显变化，此条件下各低聚糖类成分的稳定性良好，见表3。
2.4.5物理吸附的考察分别取肠段和灌流管置于含OMO 12.001 g・L-1的灌流液中37 ℃恒温水浴孵育30 min，孵育前后的供试品溶液，按2.3项下操作，以后者对前者的各组分峰面积比值计算绝对回收率。各组分的绝对回收率均大于95%，表明大鼠肠壁和灌流管对OMO中5种低聚糖类成分基本无物理吸附，见表4。 2.5大鼠在体肠灌流试验[7-8]
2.5.1方法取生理盐水、OMO灌流液、供试液和收集液小瓶置37 ℃恒温水浴，将禁食过夜的大鼠(自由饮水) ，腹腔注射20%乌拉坦溶液(200 mg・kg-1) 麻醉。背位固定，沿腹中线打开腹腔，选取实验所需的各个肠段，取约10～15 cm于两端切口，插管并结扎，用预热至37 ℃的生理盐水缓慢地将肠内容物冲洗干净，然后用生理盐水冲洗30 min，将伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿，红外灯下保温。实验时取一定浓度的OMO灌流液(预热37 ℃) 100 mL，先以1.0 mL・min-1的流速灌流10 min，再将流
速调为约0.2 mL・min-1，开始计时，每隔15 min迅速更换1次已知质量的供试液小瓶和收集液小瓶，直至120 min，称质量，计算灌入和收集的供试液质量。实验结束后，剪下被考察肠段，测量其长度(L)和横截面半径(r)。
大鼠各个肠段的选择：十二指肠段自幽门1 cm处开始向下取10 cm，空肠段距幽门15 cm处开始向下取10 cm，回肠段自盲肠上行20 cm处开始向下取10 cm，结肠段从盲肠后段开始向下取10 cm。
2.5.2灌流液体积的校正及数据处理小肠不仅吸收药物，也吸收和分泌水分，导致灌流液体积变化，因此，不能用直接测定药物浓度的方法计算药物的吸收。本实验采用重量法对灌流液流入和流出的体积进行校正，消除其体积变化的影响。具体步骤为精密量取供试液0.50 mL 放入已经称重的干净玻璃瓶中，称量液体的质量，算出其密度ρin。从接收液样品中精密量取0.50 mL，放入已经称重的干净玻璃瓶中，称量液体的质量，计算出接收液的平均密度ρout。Vin=min/ρin;Vout= mout /ρout;式中min，mout分别为一定时间内进出肠道灌流液的质量。按下面的公式计算药物吸收速率常数(Ka) 和药物表观渗透系数(Papp) ，式中Vin和Vout分别为灌入和收集的供试液体积(mL);Cin和Cout分别为进口和出口处缓冲液中的药物质量浓度(g・L-1);L和r分别为被考察肠段长度(cm) 和半径(cm);Qin为灌流速度(0.2 mL・min-1) ;t为灌流时间(h);由灌流前后剩余药量差值求出每小时单位面积肠壁上的各组分的累积吸收量A(μg・cm-2・h-1);Ka，Papp，A为8个时间段(0～120 min)样品的平均值。测定结果以±s表示，组间差异比较采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异有显著性。
Papp=-QinlnCoutCin×VoutVin2πrL(1)
Ka=1-CoutCin×VoutVin×Qinπr2L(2)
A=Cin×Vin-Cout×Vout2πrLt(3)
2.6灌流液pH对OMO在体肠吸收的影响
分别用pH 5.4，6.8，7.4的Kreb-Ringer′s灌流液(OMO质量浓度为12.1 g・L-1)对全肠段灌流，考察pH对OMO在全肠段吸收的影响。
经方差分析，蔗糖在pH 7.4，6.8，5.4灌流液中的Papp无显著性差异;蔗果三糖、巴戟甲素在pH 7.4灌流液中的Papp与pH 6.8，5.4有显著性差异(P<0.05);耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖在pH 5.4灌流液中的Papp与pH 7.4有显著性差异(P<0.05)，pH 7.4与pH 6.8之间无显著性差异。各低聚糖在pH 7.4灌流液中的Papp与Ka均较大，因此选择pH 7.4的灌流液进行试验，见表5。
2.7OMO浓度对肠吸收的影响
分别用OMO质量浓度为6.01，12.02，24.04 g・L-1的Kreb-Ringer′s灌流液(pH 7.4)对全肠段灌流，考察药物浓度对其吸收的影响。
经方差分析，OMO中5种成分在各自的3个实验浓度范围内，在大鼠全肠段的吸收速率(Ka)均无显著差异，其药物累积吸收量随灌流液药物浓度的增加而近似线性地增加，说明药物不存在自身浓度
表5OMO中5种成分在不同pH灌流液中的吸收参数(±s，n=6)
Table 5Effects of perfusate′s pH on the Ka and Papp of five oligosaccharides in rats(±s，n=6)
抑制现象，提示OMO中5种低聚糖成分的在体肠吸收机制均以被动扩散为主，其吸收动力学符合一级过程。
对各成分在全肠段的吸收进行比较，方差分析结果显示，高浓度和中浓度下，巴戟甲素与其他各成分之间的Ka存在显著性差异(P<0.05);在低浓度下，巴戟甲素与蔗糖的吸收不存在显著性差异，与其他3个成分之间存在显著性差异(P<0.05)。同时，巴戟甲素的吸收参数(Ka，Papp，A)均大于其他各成分。各成分的吸收速率依次为：巴戟甲素>蔗糖>蔗果三糖>耐斯糖>1F-果呋喃糖基耐斯糖，见表6。
2.8OMO在大鼠不同肠段中的吸收特点
取OMO质量浓度为12.02 g・L-1的灌流液分别在十二指肠、空肠、回肠和结肠 4个肠段进行灌流，考察OMO在大鼠各肠段的吸收情况。 分别对5种低聚糖成分在各肠段的吸收参数进行方差分析，结果显示，蔗糖、蔗果三糖在十二指肠
吸与回肠、结肠的吸收有显著性差异(P<0.05)，而十二指肠与空肠之间无显著性差异，其中空肠的吸收速率较大，说明蔗糖、蔗果三糖的吸收部位主要在空肠，各肠段的吸收速率依次为空肠>十二指肠>回肠>结肠;耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖在十二指肠的吸收与回肠、结肠的吸收有显著性差异(P<0.05)，而十二指肠与空肠之间无显著性差异，其中十二指肠的吸收速率较大，说明耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的吸收部位主要在十二指肠，各肠段的吸收速率依次为十二指肠>空肠>回肠>结肠;巴戟甲素在十二指肠的吸收与空肠、回肠、结肠的吸收均有显著性差异(P<0.05)，说明巴戟甲素的吸收部位主要在十二指肠，各肠段的吸收速率依次为十二指肠>空肠>回肠>结肠。
对不同肠段中各成分的吸收进行比较，方差分析结果显示，在十二指肠肠段，巴戟甲素与其他各成分之间均具有明显的统计学差异(P<0.05)，且巴戟甲素的吸收参数(Ka，Papp，A)均大于其他成分，提示十二指肠段巴戟甲素的吸收相对较快，吸收速率依次为巴戟甲素>蔗糖>蔗果三糖>耐斯糖>1F-果呋喃糖基耐斯糖;在空肠肠段，巴戟甲素与蔗糖、蔗果三糖之间无显著性差异，巴戟甲素与耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖之间均有显著性差异(P<0.05)，提示空肠段巴戟甲素与蔗糖、蔗果三糖的吸收情况相似，吸收速率依次为巴戟甲素>蔗果三糖>蔗糖>耐斯糖>1F-果呋喃糖基耐斯糖;在回肠肠段，巴戟甲素与蔗糖之间无显著性差异，巴戟甲素与蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖之间均有显著性差异(P<0.05)，提示回肠段巴戟甲素与蔗糖的吸收情况相似，吸收速率依次为蔗糖>巴戟甲素>蔗果三糖>1F-果呋喃糖基耐斯糖>耐斯糖;结肠段与回肠段比较结果一致，其吸收速率依次为蔗糖>巴戟甲素>蔗果三糖>1F-果呋喃糖基耐斯糖>耐斯糖，见表7。
2.9P-gp抑制剂对OMO肠吸收的影响
以盐酸维拉帕米作为P-gp抑制剂，分别在pH 7.4的Kreb-Ringer′s灌流液(OMO质量浓度12.02 g・L-1)中加入盐酸维拉帕米至0，0.6 mmol・L-1作为2组供试液。实验前分别用2组供试液以2.0 mL・min-1的流速快速平衡孵育肠段和灌流管10 min，其他操作同2.5.1项。对十二指肠灌流，考察P-gp抑制剂对OMO吸收的影响。
对各成分的2组吸收参数进行统计分析，结果显示，加入P-gp抑制剂对蔗糖与巴戟甲素的Ka，Papp均有显著性影响(P<0.05)，而对其他成分无显著性影响(P>0.05)。盐酸维拉帕米可显著增加蔗糖与巴戟甲素的吸收量，这种促吸收效果是通过抑制P-gp的外排引起的，由此提示蔗糖与巴戟甲素是P-gp的底物，见表8。
3讨论
本实验以OMO为研究对象，主要含有蔗糖(二糖)、巴戟甲素(二糖)、蔗果三糖(三糖)、耐斯糖(四糖)、1F-果呋喃糖基耐斯糖(五糖)等低聚糖成分，实验结果中显示在全肠段吸收中，其吸收速率依次为二糖>三糖>四糖>五糖，推测可能与各成分的分子大小有关。在本实验条件中，各成分在不同肠段中的Papp均大于0.072 cm・h-1，说明各低聚糖成分在整个肠段中吸收良好[9]，属于高渗透性药
物，主要与各成分均具有较强的亲水性从而易于在肠道中吸收扩散进入体内有关。
药物进入体循环的速度和程度是决定药物疗效及安全性的重要因素，药物只有在预期的时间内释放并被有效部位吸收才能产生疗效，故研究药物的肠吸收特点将可以减少剂型设计的盲目性，为剂型的开发提供科学依据。从实验结果中可看出，巴戟天低聚糖中的成分主要在小肠段(十二指肠、空肠)中吸收，因此，可设计相应的缓控释制剂，准确控制药物释放的部位和速率，提高巴戟天低聚糖的口服生物利用度。
与离体肠吸收实验相比，在体肠灌流法因不切断血管和神经系统，提高了肠段的生物活性。在体肠灌流主要分为在体单向肠灌流和在体循环肠灌流，在体循环肠灌流因灌流时间长(4～6 h)和灌流速度较大(2～5 mL・min-1)对肠道的肠黏膜损伤较大，导致药物的吸收增加，造成实验结果与真实情况存在较大误差[10-12]。灌流速度在一定程度上代表肠道蠕动的生理状态，在健康志愿者体内肠灌流实验中，灌流速度多选用2～3 mL・min-1，由于大鼠肠道的内径约为人肠道的1/10，因而单向肠灌流以较低灌流速度(0.2～0.3 mL・min-1)对需要考察的肠段进行单向灌流，其吸收速率稳定，与人体肠吸收有良好的相关性[13]。
P-gp属多药耐药蛋白，通过将药物从细胞内主动转运到细胞外，参与药物的吸收和靶组织转运，具有重要的生理学功能。当某一药物或化学成分影响了P-gp的活性，则能改变另一种药物或成分的吸收速率及吸收程度，并最终影响其血药浓度。实验结果表明，盐酸维拉帕米可显著增加蔗糖与巴戟甲素的吸收量，这种促吸收效果是通过抑制P-gp的外排引起的，由此提示蔗糖与巴戟甲素是P-gp的底物，其相关的作用机制有待进一步的研究。 [参考文献]
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